《Advanced Science》：Activated Platelet–Released Heat Shock Protein 90α Triggers Autophagy-Dependent Neutrophil Extracellular Trap Formation and Amplifies Sepsis
编辑推荐：
本研究揭示了血小板在脓毒症血栓炎症中的关键新机制。研究发现，脓毒症患者血小板中热休克蛋白90α（HSP90α）显著上调。当血小板活化时，HSP90α会转运并释放到胞外空间。胞外的HSP90α作为一种损伤相关分子模式（DAMP），通过与中性粒细胞表面的Toll样受体4（TLR4）结合，激活下游MyD88-Beclin 1信号通路，诱导自噬，最终驱动中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成，加剧凝血异常和炎症。阻断胞外HSP90α可有效抑制NET形成，减轻血栓和器官损伤。该“血小板-HSP90α-TLR4-自噬-NET”轴为理解脓毒症免疫血栓形成提供了新见解，并提示靶向eHSP90α是潜在的治疗新策略。
脓毒症是一种危及生命的疾病，其器官功能障碍源于宿主对感染反应的失调，凝血病是导致多器官衰竭和死亡率增加的关键因素。血小板在脓毒症血栓和凝血异常的发生中至关重要，但其促发病理过程的机制尚未完全阐明。本研究发现，血小板释放的热休克蛋白90α是驱动中性粒细胞胞外诱捕网形成和支持脓毒症期间血栓炎症的关键角色。
血小板中HSP90α表达上调源于巨核细胞TLR4信号
对脓毒症患者血小板进行蛋白质组学分析显示，HSP90α显著增加。通过转录组分析和体内外实验验证，研究者将这一上调追溯至起源于巨核细胞的运输途径。巨核细胞在脓毒症期间通过Toll样受体4信号感知炎症，导致HSP90α mRNA表达增加，并随后将其传递给血小板。在TLR4-/-脓毒症小鼠的巨核细胞和血小板中，Hsp90aa1表达显著降低，证实了TLR4信号对于脓毒症期间巨核细胞HSP90α上调至关重要。
血小板活化触发HSP90α膜转位和释放
在静息血小板中，HSP90α弥散分布在胞质内。当被凝血酶激活后，HSP90α重新定位于质膜，形成特征性的环状模式，这一过程依赖于肌动蛋白聚合。流式细胞术和免疫印迹分析进一步证实，血小板活化后，HSP90α在质膜表达增加，在细胞内减少，并且HSP90α存在于血小板释放物的胞外部分。酶联免疫吸附试验检测到凝血酶刺激的血小板上清液中存在HSP90α。研究表明，HSP90α在被血小板释放时，既以游离形式存在，也与外泌体相关。此外，与健康供体相比，脓毒症患者来源的血小板释放的HSP90α水平显著增加，并且脓毒症患者的血小板贫乏血浆（富含凝血酶）也能刺激血小板将HSP90α动员至膜表面。
血小板释放的HSP90α通过中性粒细胞加剧脓毒症诱导的血栓形成
在脓毒症小鼠模型中，血浆HSP90α水平显著升高，而使用抗血小板抗体耗竭血小板可使血浆HSP90α水平降低约49%，表明血小板是脓毒症期间循环eHSP90α的主要来源。使用靶向HSP90α的特异性中和抗体1G6-D7处理脓毒症小鼠，可显著降低凝血酶-抗凝血酶复合物水平，恢复纤维蛋白原水平，并明显减少肝脏和肺组织中的血栓形成和血小板聚集。同时，促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的系统性水平也显著降低。为探究eHSP90α促血栓作用的机制，研究者通过分析公开的单细胞RNA测序数据，将中性粒细胞锁定为eHSP90α介导的血栓炎症反应的潜在效应细胞。在脓毒症小鼠中使用抗Ly6G抗体选择性耗竭中性粒细胞，可显著减轻HSP90α相关的凝血异常和血栓形成，并抑制系统性炎症。这些结果表明，中性粒细胞是脓毒症期间eHSP90α触发血栓炎症反应的关键贡献者。
eHSP90α通过激活中性粒细胞自噬触发胞外诱捕网形成
研究发现，脓毒症患者血浆中NET形成显著增加，且血浆HSP90α水平与NET形成呈正相关。在体外，用脓毒症患者PPP或血小板与中性粒细胞共培养可诱导NET形成，而用中和抗体1G6-D7阻断eHSP90α则可显著抑制此过程。直接用重组HSP90α刺激中性粒细胞能以剂量依赖性方式增强NET形成。在体内，1G6-D7治疗也能显著抑制脓毒症模型中的NET形成。已知NET形成需要自噬参与。单细胞RNA测序分析显示，脓毒症患者中性粒细胞中自噬相关基因表达和自噬评分更高。透射电镜观察到，重组HSP90α刺激后中性粒细胞胞质内自噬体和自溶体积累增加。免疫印迹和共聚焦显微镜证实，重组HSP90α可上调LC3B-II、下调p62，诱导自噬体形成，而HSP90α抗体及自噬抑制剂3-MA和Bafilomycin A1可部分逆转此效应。同时，HSP90α诱导的NET形成也能被这些抑制剂显著抑制。这些发现表明，胞外HSP90α通过诱导中性粒细胞自噬来触发NET形成。
eHSP90α通过TLR4诱导中性粒细胞自噬
为探索eHSP90α诱导自噬的机制，研究者考察了TLR4的参与。共免疫沉淀实验和免疫荧光分析证实了eHSP90α与TLR4胞外域的直接相互作用。用TLR4及其下游衔接蛋白MyD88的药理抑制剂处理中性粒细胞，可显著抑制HSP90α诱导的自噬流。蛋白质G/A琼脂糖珠共免疫沉淀实验显示，在HSP90α刺激的中性粒细胞中，MyD88和Beclin 1之间的相互作用增强，同时Beclin 1与Bcl-2复合物被破坏。重要的是，HSP90α刺激导致中性粒细胞中磷酸化Beclin 1水平显著增加，而HSP90α中和抗体及TLR4和MyD88抑制剂可减弱此效应。抑制TLR4或MyD88也能显著减少NET形成。使用TLR4-/-小鼠进一步验证了TLR4的作用：与野生型小鼠相比，TLR4-/-小鼠的中性粒细胞对HSP90α诱导的自噬和NET形成反应减弱，对脓毒症来源血小板诱导的NET形成也受损。这些发现证明，eHSP90α通过TLR4/MyD88/Beclin 1依赖性信号通路驱动中性粒细胞自噬及随后的NET形成。
讨论与意义
本研究阐明了脓毒症中血小板与NET相互作用的一条新通路。HSP90α在脓毒症血小板中显著上调，并源自巨核细胞。血小板活化后释放的HSP90α，通过TLR4/MyD88/Beclin 1信号通路诱导自噬驱动的NET形成。使用HSP90α中和抗体1G6-D7可有效抑制该通路，减少NET形成，从而减轻脓毒症相关血栓和炎症。这加深了我们对血小板诱导免疫血栓形成的理解。目前大多数抗血栓疗法通过靶向血小板活化相关的膜受体或细胞内信号通路发挥作用，但在脓毒症患者中可能增加出血风险。本研究提示，靶向致病性血小板衍生因子（如eHSP90α）而非血小板活化本身，可能提供一种更安全有效的治疗策略。然而，研究也存在一定局限性，如临床样本均来自儿童，向成人脓毒症的推演需谨慎；HSP90α广泛表达，其中和抗体的潜在脱靶效应和长期安全性需严格的临床前评估。总之，该研究强调了血小板源性eHSP90α在驱动自噬依赖性NET形成中的关键作用，并提出靶向eHSP90α可能是治疗脓毒症血栓的一种有潜力的新方法。
