《Advanced Science》：ERAD Component MoHrd3 Facilitates Pathogenicity and Establishes a Direct Regulation on Autophagy in Magnaporthe Oryzae
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这项研究首次揭示了ERAD关键组分MoHrd3在水稻稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中的新功能：它不仅通过MoHrd1-MoHrd3复合物介导经典的泛素-蛋白酶体降解途径，更作为衔接蛋白（adaptor protein）直接调控自噬。研究发现，MoHrd3通过与自噬体膜上的MoAtg8和液泡膜上的MoYpt7相互作用，促进自噬体与液泡的融合，这一过程对病原菌的感染性自噬至关重要。更重要的是，MoHrd3还介导了G蛋白偶联受体MoPth11的自噬性降解，从而精细调控附着胞形成与致病性。该工作建立了ERAD与自噬之间直接的分子联系，为理解病原真菌的蛋白质量控制网络及其毒力调控机制提供了新视角。
2.1 MoHrd3对稻瘟病菌生长、产孢及致病性至关重要
Hrd3是从酵母到高等真核生物中保守的ERAD组分。通过同源比对，研究人员在稻瘟病菌中鉴定出其同源蛋白MoHrd3（基因座MGG_13508）。为探究其功能，研究者利用同源重组策略构建了三个MoHrd3敲除突变体（ΔMohrd3）。表型分析发现，ΔMohrd3突变体在燕麦番茄琼脂（OTA）培养基上的菌落生长显著受限。此外，突变体的产孢能力也严重下降。重要的是，无论是喷雾接种还是伤口接种实验，ΔMohrd3突变体在水稻叶片上形成的病斑数量和大小都显著小于野生型P131菌株和回补菌株（cMoHrd3），这直接证明了MoHrd3对于稻瘟病菌的致病性是必需的。
2.2 MoHrd3为附着胞成熟和侵染菌丝生长所必需
为了解MoHrd3如何影响致病性，研究者进一步观察了附着胞的形成过程。在疏水性盖玻片上，野生型P131的分生孢子接种6小时后超过80%形成了黑色化的成熟附着胞，而ΔMohrd3突变体的附着胞成熟率低于40%。深入分析发现，突变体中负责提供膨压的糖原和脂质的利用率下降，参与附着胞穿透所必需的septin环结构形成异常，并且附着胞的坍塌率显著升高，表明其膨压不足。在水稻鞘细胞侵染实验中，接种36小时后，约70%的P131或cMoHrd3侵染点形成了具有一个或多个分支的侵染菌丝，而超过80%的ΔMohrd3突变体仅停留在附着胞阶段。这些结果说明，MoHrd3在侵染早期的附着胞成熟、穿透以及后期的侵染菌丝扩展中都扮演着关键角色。
2.3 MoHrd3是稻瘟病菌中保守的MoHrd1复合物ERAD组分
亚细胞定位显示，MoHrd3-GFP与内质网标记蛋白mCherry-HDEL在菌丝、分生孢子和附着胞中广泛共定位，证实其为内质网定位蛋白。分裂泛素酵母双杂交实验进一步证明MoHrd3与已知的ERAD组分MoHrd1和MoDer1直接相互作用，提示它们可能形成ERAD相关复合物。由于ERAD功能缺陷会引发内质网应激，导致未折叠蛋白反应（UPR）基因上调。实验发现，在ΔMohrd3突变体中，多个UPR标志基因（如MoKAR2、MoPDI等）的表达均被显著诱导。同时，突变体对可诱导ER应激的药物衣霉素（TM）更为敏感。此外，ΔMohrd3突变体的整体蛋白质泛素化水平显著降低。这些证据共同表明，MoHrd3在稻瘟病菌中是一个保守的ERAD组分，参与底物识别。
2.4 MoHrd3功能缺失导致稻瘟病菌自噬水平降低
为了探索MoHrd3调控的通路，研究者对MoHrd3-GFP纯化蛋白进行了LC-MS/MS分析，发现多个与自噬密切相关的分选和液泡膜组分蛋白。透射电镜观察显示，在氮饥饿（MM-N）诱导下，野生型P131菌丝细胞的液泡内积累了多个自噬体，而ΔMohrd3突变体中自噬体数量显著减少。利用自噬标志蛋白GFP-MoAtg8进行观察发现，在基本培养基（CM）中，ΔMohrd3突变体细胞质中积累了更多、荧光更强的GFP-MoAtg8斑点；在氮饥饿诱导后，P131中大部分GFP信号进入液泡，而ΔMohrd3中仍有部分信号滞留在细胞质，表明自噬体与液泡的融合可能受阻。通过分析GFP-MoAtg8的降解和内源性MoAtg8的脂化形式MoAtg8-PE的降解，进一步证实ΔMohrd3突变体的自噬通量降低。这些结果支持MoHrd3这一保守的ERAD组分在自噬调控中发挥着重要作用。
2.5 MoHrd3在稻瘟病菌中与MoAtg8结合并共定位
酵母双杂交实验表明，MoHrd3特异性与自噬关键蛋白MoAtg8相互作用，但不与MoAtg1作用。这一相互作用在体内通过免疫共沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补（BiFC）实验得到进一步验证。BiFC实验显示，MoHrd3与MoAtg8在自噬体上互作，且使用液泡ATP酶抑制剂Concanamycin A（ConA）处理（诱导自噬体积累）后，互作信号增强。共定位分析显示，在ConA处理或饥饿条件下，MoHrd3-GFP与mCherry-MoAtg8在自噬体或液泡中共定位。此外，研究发现MoHrd3本身可通过自噬途径被降解，因为自噬抑制剂3-MA能增加MoHrd3的蛋白积累，而蛋白酶体抑制剂MG132则无此效应。
2.6 MoHrd3通过增强MoYpt7与MoAtg8的相互作用来促进自噬
对IP-MS数据的重新分析发现，液泡膜蛋白MoYpt7（参与自噬）是MoHrd3的潜在互作蛋白。酵母双杂交、Co-IP和BiFC实验均证实了MoHrd3与MoYpt7的直接相互作用。有趣的是，与酵母系统不同，在稻瘟病菌中，MoAtg8也能通过Co-IP检测到与MoYpt7的相互作用。关键发现是，MoHrd3的存在显著增强了MoAtg8与MoYpt7之间的结合。相反，在ΔMohrd3突变体中，MoAtg8与MoYpt7的相互作用明显减弱，而这种减弱可通过在Co-IP体系中添加重组的MoHrd3蛋白来挽救。基于AI的模型预测显示，MoHrd3通过其C端区域招募MoAtg8，并通过其N端大结构域结合MoYpt7，暗示三者可能形成三元复合物。在ΔMohrd3突变体中过表达MoAtg8或MoYpt7，可以部分恢复其致病性缺陷，这从遗传学角度证实了MoHrd3通过促进MoAtg8与MoYpt7的互作来调控自噬，进而影响致病性。
2.7 MoHrd3介导的自噬对稻瘟病菌的致病性至关重要
为了模拟侵染过程引发的内质网应激条件，研究者使用了DTT（一种ER应激诱导剂）进行处理。DTT处理后，P131和ΔMohrd1突变体中的GFP-MoAtg8大多转移至液泡，而ΔMohrd3突变体中的信号仍滞留在细胞质中。当同时使用DTT和自噬体-液泡融合抑制剂Bafilomycin A1（Baf）处理时，P131和ΔMohrd1中的GFP-MoAtg8也被阻滞在细胞质，表型与ΔMohrd3相似。自噬通量分析也显示，DTT诱导的自噬在ΔMohrd3中大幅减弱。重要的是，DTT处理增强了MoAtg8与MoHrd3的相互作用。致病性实验发现，Baf处理能抑制野生型P131和ΔMohrd1的致病性，但对ΔMohrd3突变体的致病性没有进一步影响，这表明MoHrd3介导的自噬体与液泡融合过程对稻瘟病菌的致病性至关重要。
2.8 MoHrd3作为衔接蛋白促进GPCR蛋白MoPth11的自噬性降解
MoHrd3直接结合MoAtg8并可被自噬降解，这符合选择性自噬受体的特征。然而，对预测的多个ATG8相互作用基序（AIM）进行点突变后，MoHrd3与MoAtg8的相互作用依然存在，表明这种结合是AIM非依赖性的。进一步实验发现，MoAtg8无法与C端缺失的MoHrd3结合，说明MoHrd3通过其C端与MoAtg8结合，因此它不是典型的选择性自噬受体。由于在ERAD通路中，Hrd3作为衔接蛋白识别底物以进行蛋白酶体降解，研究者推测MoHrd3可能也作为衔接蛋白介导其靶蛋白的自噬性降解。他们选择了一个对于附着胞形成和致病性至关重要的非典型G蛋白偶联受体MoPth11进行研究。酵母双杂交和Co-IP实验证实，MoPth11与MoHrd3以及MoHrd1均存在相互作用。在饥饿条件下，ΔMohrd3突变体中MoPth11的泛素化水平显著降低。蛋白质稳定性实验表明，MoPth11的降解被自噬抑制剂3-MA抑制，而不受蛋白酶体抑制剂MG132影响，且MoPth11-GFP在饥饿条件下定位于液泡。这些结果说明MoPth11可通过自噬途径降解。在ΔMohrd3突变体中，MoPth11的自噬性降解被废除，其蛋白持续积累。类似地，MoHrd1的缺失也影响了饥饿诱导的MoPth11泛素化和积累。综合来看，MoPth11在经历由MoHrd1-MoHrd3复合物介导的泛素化后，通过MoHrd3作为衔接蛋白引导，被自噬途径降解。致病性分析发现，无论是在P131背景还是ΔMohrd3、ΔMohrd1突变体背景中过表达MoPth11，都会导致致病性下降，这与MoPth11敲除突变体的表型类似，表明维持适当的MoPth11蛋白水平对稻瘟病菌的致病性至关重要。
3 讨论
内质网相关降解（ERAD）和自噬是维持内质网稳态的两个主要策略。本研究首次在稻瘟病菌中发现，ERAD组分MoHrd3通过促进自噬体与液泡的融合来调控自噬水平。具体机制是，MoHrd3同时与MoAtg8和MoYpt7相互作用，并作为衔接蛋白增强两者之间的结合，从而促进侵染诱导的自噬进程。此外，MoHrd3还作为一个衔接蛋白，在MoHrd1-MoHrd3复合物介导MoPth11泛素化后，引导其通过自噬途径降解，以此调控致病性。MoHrd3本身也能通过自噬途径被降解。ΔMohrd3突变体中，自噬体-液泡融合严重受损导致自噬减少，同时MoPth11等靶蛋白积累，共同导致致病性下降。这项研究建立了ERAD与自噬通路之间的直接分子联系，揭示了ERAD组分在自噬中的直接作用，并为理解稻瘟病菌的毒力调控机制提供了新见解。
