《Advanced Science》：A Renal Clearable Probe for In Vivo Monoamine Oxidase (MAO) Detection
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这篇研究报道了一种新型肾清除型荧光探针“Cy7-MAO”，用于在活体动物中通过简单尿液荧光检测，实现对单胺氧化酶（MAO）过表达的非侵入式、纵向监测。该探针在MAO存在时被特异性激活，释放强荧光信号并经肾脏排泄，成功应用于区分年轻与老年小鼠的MAO活性差异，为研究衰老及相关疾病（如神经退行性疾病）提供了一种新工具。
1 引言
单胺氧化酶（Monoamine Oxidase， MAO）的过度活化与神经毒性化合物（如活性氧， ROS）的失控产生有关，其积累与神经退行性疾病、慢性病及年龄相关疾病存在关联。尽管已有用于检测和量化MAO活性的显色/荧光探针被报道，但能够在体内非侵入式监测MAO过表达的方法仍十分有限。
传统的诊断技术，如磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）和计算机断层扫描（CT），成本高、需要专业设备和人员，且部分需要注射可能引起不良反应的造影剂。因此，设计非侵入式、经济高效的诊断方案备受关注。基于尿液的检测平台代表了重大进展，它便于识别生物标志物，并可作为传统生物成像模式的有力补充甚至替代方案。
一种极具创新性的尿液诊断工具开发方法是制备可产生强荧光团并随后通过尿液排出的探针。在此机制下，处于“关闭”（OFF）状态的探针在特定细胞生物标志物作用下转化为处于“开启”（ON）状态的高荧光团，且该荧光团被设计为可快速肾清除，使其能经肾脏过滤到达膀胱，随尿液排出，从而实现尿液中易于检测的荧光信号。基于此，生物标志物可通过尿液分析来检测。
MAO酶因其在神经递质代谢及过氧化氢（H2O2）等ROS生成中的核心作用而成为一个极具吸引力的靶点。这些黄素酶位于线粒体外膜，存在于体内大多数细胞类型中。MAO有两种亚型：MAO-A和MAO-B，它们具有70%的序列同源性，但底物和抑制剂特异性不同。MAO-A主要裂解血清素、褪黑素、去甲肾上腺素和肾上腺素，而MAO-B作用于苯乙胺和苄胺。在此氧化脱胺过程中，MAO活性会产生活性氧作为副产物。组织中MAO水平的特定变化已在年龄相关疾病中被描述，因为增加的氧化应激和线粒体功能障碍是细胞和器官功能的关键因素。ROS的积累与多种神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病或肌萎缩侧索硬化症）以及高血压、代谢紊乱和慢性肾病等慢性疾病的内皮功能障碍的发病机制有关。
尽管MAO酶参与各种病理和年龄相关状况，但在体内监测其组织特异性变化的工具极其有限或不存在。文献中描述的几种检测MAO过表达的方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、高效液相色谱（HPLC）或分光光度测定法，通常依赖于组织提取或细胞裂解等终端程序，无法进行纵向测量。因此，其实用性主要局限于体外和离体检测。许多探针依赖传统荧光团，存在水溶性差、在生物环境中量子产率低、非特异性背景荧光和清除有限等问题。在此背景下，肾清除型“关-开”（OFF–ON）荧光探针成为在体内动态监测MAO活性的一个有前景的替代方案。
本文报告了一种基于花青素-7（cyanine-7）荧光团的荧光分子探针“Cy7-MAO”。该探针含有丙胺基团作为MAO识别部分。其传感机制基于在MAO酶存在下荧光信号的增强，这些酶将弱荧光的Cy7-MAO分子转化为高荧光的Cy7荧光团。为实现尿液分析，探针骨架含有两个磺酸基团以增强溶解度并促进体内快速肾清除，而探针的两性离子性质也有望减少与非特异性蛋白的结合及被健康组织的摄取。Cy7-MAO提供了一种稳健且通用的方法，首次实现了通过在活体动物中收集尿液来对MAO活性进行非侵入式、纵向监测。
2 结果与讨论
2.1 Cy7-MAO探针的合成与表征
Cy7-MAO通过两步法合成。首先在BOC保护的3-溴丙胺和5-甲酰基水杨醛之间进行亲核取代反应，然后用TFA脱除BOC保护基，得到中间体化合物1。第二步，1与2,3,3-三甲基-1-(4-磺酸丁基)吲哚鎓（2）进行Knoevenagel缩合，得到最终的Cy7-MAO探针。该探针通过硅胶色谱纯化，并通过1H-NMR、13C-NMR和高分辨质谱（HRMS）进行了全面表征。
Cy7荧光团具有良好的生物成像光物理特性（近红外发射），但其在生物介质中的应用需谨慎评估，因为它可水解为也具有荧光的半花青醛（hemiCy7）。为评估Cy7-MAO探针的适用性，通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）研究了其与Cy7的稳定性。将Cy7-MAO和Cy7在HEPES缓冲液（pH 7.4）中制备溶液，使用配备三重四极杆飞行时间（Q-TOF）检测器的质谱仪记录质谱色谱图，同时监测745 m/z（Cy7-MAO探针）和705 m/z（Cy7荧光团）的离子。结果显示，24小时后，用于监测Cy7-MAO存在的分子离子丰度保持不变，而Cy7荧光团的丰度急剧下降（约92%），这与Cy7水解为hemiCy7有关。
紫外-可见光（UV-vis）测量也证实了所提出的水解过程。Cy7荧光团的HEPES溶液在约600 nm处有一个明显的吸收带，该吸收带随时间逐渐减弱，同时在约450 nm处出现一个新吸收带，归因于Cy7水解后形成的hemiCy7。荧光测量得到了相同结果：在580 nm激发下，观察到Cy7荧光团在约670 nm处的特征发射，但该发射带逐渐减弱，24小时后几乎消失；相反，在450 nm（hemiCy7的吸收）激发下，24小时后在约535 nm处发现一个发射带。这些研究证实了Cy7水解后形成hemiCy7。hemiCy7也被合成并通过核磁共振（NMR）以及紫外-可见吸收光谱和荧光光谱进行了表征，验证了所提出的水解途径并确认了Cy7水解产物的身份。尽管Cy7荧光团在长时间内存在固有稳定性问题，但结果也证实Cy7-MAO探针在生理pH的水性缓冲液中保持化学稳定，这支持了其在生物应用中的潜在效用。
2.2 使用Cy7-MAO探针选择性检测MAO
在模拟生理条件下，研究Cy7-MAO在存在或不存在MAO-A或MAO-B酶时的光物理性质。在典型实验中，将Cy7-MAO与MAO-A或MAO-B混合，并在37°C下孵育24小时以允许探针被酶完全介导氧化脱胺。24小时后，在535 nm处测量发射强度（激发波长450 nm，即此时由Cy7水解得到的hemiCy7衍生物的发射波长）。起始的Cy7-MAO溶液在450 nm激发下荧光微弱，而加入两种酶（100 μg·mL?1）孵育24小时后，在535 nm处观察到宽荧光带，发射强度分别增强了13.2倍（MAO-A）和9.7倍（MAO-B）。
接下来，监测Cy7-MAO探针在不同量MAO-A或MAO-B存在下孵育24小时后的荧光发射。发现535 nm处的发射强度显著增加，且与所添加酶的量成正比。这些数据用于确定两种酶的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。对于MAO-A和MAO-B，LOD分别为6.4和10.9 μg·mL?1，LOQ值分别为29.3和52.1 μg·mL?1。这些结果表明Cy7-MAO探针可用于两种MAO亚型的定性和定量检测。
进一步研究其酶促动力学行为，分析了Cy7-MAO与MAO-A和MAO-B的反应动力学。米氏分析得出以下催化参数：对于MAO-A，最大反应速度（Vmax）为16.13 μM·min?1，米氏常数（Km）为10.63 μM；对于MAO-B，Vmax为35.71 μM·min?1，Km为17.82 μM。MAO-A较低的Km表明Cy7-MAO对该亚型具有更高的表观亲和力。相反，MAO-B较高的Vmax反映了在底物饱和条件下更大的催化能力。这些结果表明Cy7-MAO能被两种MAO亚型有效识别和处理，尽管动力学特征不同，证实了其作为监测MAO活性的灵敏可靠探针的适用性。
为探究Cy7-MAO与MAO-A和MAO-B亚型之间的结合取向和分子相互作用，使用AutoDock Tools平台进行了分子对接研究。分析结果显示，配体适配于两种亚型的活性位点空腔。在一些生成的簇中，Cy7-MAO的含氨基末端接近MAO酶中天然存在的FAD辅因子。基于结合能和更多簇的考虑，对MAO-A和MAO-B与Cy7-MAO最具潜力的复合物进行了200纳秒的分子动力学（MD）模拟稳定性分析。模拟结果显示，两种亚型的复合物在模拟时间内保持稳定，含有氨基的侧链始终保持在FAD附近，而FAD被指出是酶的催化位点。两种情况下，Cy7-MAO的氨基都朝向FAD催化位点的N5和羰基。探针在活性位点空腔中稳定的一个原因很可能与两个Tyr残基形成的芳香笼有关。计算机模拟结果与实验结果一致，有助于解释Cy7-MAO如何结合MAO-A和MAO-B亚型，以催化氧化Cy7-MAO中的单胺生成Cy7。
还评估了Cy7-MAO探针在几种潜在干扰物存在下检测MAO-A和MAO-B的选择性。如图4c所示，只有两种MAO亚型能诱导Cy7-MAO的发射显著增强，而在选定离子、小分子或其他酶存在下未发现变化。此外，在MAO酶及其抑制剂（MAO-A的氯吉宁和MAO-B的帕吉林）存在下进行了额外实验。两种情况下，存在抑制剂时的荧光信号比不存在时低70%，证实了所提出的机制，即发射增强是由于Cy7-MAO被MAO酶水解所致。
2.3 Cy7-MAO探针的体外验证
为进行体外验证，选择了已知过表达两种MAO亚型的人源HepG2（肝细胞癌）细胞。首先，测试了Cy7-MAO在HepG2细胞中的毒性，结果显示即使在高达200 μM的浓度下孵育48小时后也未显示毒性效应。Western blot证实了MAO在HepG2细胞中的表达，显示内源性高水平的MAO-A和MAO-B。相比之下，选择作为阴性对照的SK-Mel-103黑色素瘤人源细胞显示出极低水平的MAO-A和MAO-B酶。与Cy7-MAO探针共孵育的细胞的共聚焦图像显示，与SK-Mel-103细胞相比，HepG2细胞中荧光信号更强。这些结果证实了Cy7-MAO在HepG2细胞中的选择性水解，支持了探针在体外的MAO依赖性激活。
2.4 Cy7-MAO探针的体内验证
MAO-A和/或MAO-B酶水平通常随着年龄增长而升高，这引起了人们对其在生理衰老中潜在贡献的关注。积累的证据表明，MAO酶水平随着年龄增长在大脑和肝脏等各种组织中升高，导致ROS产生增加和线粒体功能障碍。这些过程被认为是生理衰老和年龄相关病理的关键机制。鉴于这种既定的关联，我们有兴趣评估Cy7-MAO在衰老背景下非侵入式读取MAO的能力。为此，我们使用BALB/cByJ小鼠进行了两项互补的体内实验。
在第一项侧重于探针机理验证的实验中，我们对两个不同年龄组（年轻组2个月和年老组12个月）进行了比较分析，以探索探针在检测年龄依赖性MAO差异方面的功能和特异性。小鼠腹腔注射10 mM Cy7-MAO，并通过活体成像系统（IVIS）技术监测荧光发射。注射后15分钟进行体内IVIS成像显示，注射了Cy7-MAO的年老小鼠在腹膜区域和膀胱对应的解剖区域出现荧光信号。为了量化，在所有动物中一致使用该特定感兴趣区域（ROI，即膀胱区域）来评估相对荧光信号，确认了年老小鼠中较高的荧光强度。这种模式反映了Cy7-MAO作为肾清除型可激活探针的设计：在MAO依赖性激活后，荧光Cy7产物被肾脏快速过滤，并在尿液排出前短暂集中在膀胱中。
尿液收集和安乐死后，通过IVIS成像研究了主要器官的荧光。与年轻小鼠（信号可忽略不计）相比，年老动物膀胱中的强信号也反映Cy7-MAO激活在体内以年龄依赖的方式发生，膀胱中的荧光反映了处理后的探针通过肾途径被高效清除。此外，从小鼠从麻醉中恢复后收集的尿液的荧光读数与此结果相关。腹腔注射Cy7-MAO探针15分钟后收集尿液样本，并在此缩短的时间间隔内进行分析，以专门评估Cy7荧光团的荧光。荧光计测量显示，年老小鼠的尿液荧光发射比年轻小鼠增加了5.8倍，与体内更高的Cy7-MAO激活一致。总体而言，这些发现表明Cy7-MAO在年老动物中被优先激活，这表明观察到的尿液荧光反映了年龄依赖性MAO增加。
为了证实这一点，我们通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）表征了2个月和12个月大小鼠大脑、肺、肝、肾和脾脏中Maoa和MaobmRNA水平，以此作为酶表达的替代指标。在我们的实验中，观察到肝脏中两种亚型的显著年龄依赖性增加，Maoa和Maob水平在12个月大小鼠中分别上升了约4.5倍和4倍。相比之下，其他检查器官中的MAO表达保持不变，除了肾脏也显示出Maoa的轻微增加，尤其是Maob水平在12个月大小鼠中有所增加。相反，年轻小鼠在这些器官中未显示MAO表达的显著变化。这些结果证实了在年老小鼠中观察到的尿液荧光升高反映了MAO表达（两种亚型）的生物学相关特异性增加，而年轻小鼠则未表现出此类激活。
与此一致，在探针给药15分钟后收集的尿液进行的高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）分析证实了Cy7-MAO的激活，直接将探针处理与生物靶点联系起来，并证明了活化产物的高效肾清除。在年老小鼠（12个月大）中，大约69.6 ± 5.7%的Cy7-MAO给药剂量（38 mg/kg）以Cy7荧光团形式在尿液中回收，而4.1 ± 3.3 %仍为未处理的Cy7-MAO探针。相比之下，在年轻小鼠（2个月大）中，Cy7荧光团的排泄极少（约1.5 ± 1.0%），而Cy7-MAO探针约占80.1 ± 8.1%。这些百分比是通过将尿液中检测到的探针和荧光团量与初始给药的Cy7-MAO总剂量相关联计算得出的，反映了快速的MAO介导激活和随后的肾清除。这些结果证实Cy7-MAO按设计运行，仅在年老小鼠的MAO存在时被选择性激活，并迅速高效清除，为年龄相关的MAO表达提供了稳健的非侵入式读数。剩余部分可能代表在非靶组织中的短暂循环或分布，但不影响探针的特异性或尿液读数的可靠性。
在一项补充研究中，对年老小鼠进行了更详细的功能分布分析。体内成像监测显示探针在0–20分钟内从注射部位到泌尿系统的动态转运。体内荧光信号的量化显示膀胱区域明显增加，反映了激活的Cy7荧光团的高局部浓度。体内成像在尿液收集之前进行，这与膀胱中高浓度的激活Cy7一致。离体成像显示，主要器官中残留荧光部分主要在肝脏和膀胱，其他器官信号可忽略不计。这些模式不反映积累或传统的生物分布，而是证实激活的探针通过尿液被高效清除，残留信号来自酶激活位点（如肝脏）或不完全的尿液清除。结果与Cy7-MAO作为肾清除型可激活探针的设计一致：在MAO依赖性激活后，荧光Cy7产物被肾脏系统快速处理，并在尿液排出前暂时集中在膀胱中。重要的是，在健康小鼠中的急性毒性研究表明，在测试剂量下未检测到对健康、血液化学或器官组织学的不利影响，支持了探针的生物相容性。
为了进一步研究Cy7-MAO是否能检测更渐进的、年龄相关的MAO活性变化并支持纵向研究，对处于中间年龄的小鼠进行了第二项实验。具体而言，对2、5、8和14个月大的BALB/cByJ小鼠腹腔注射Cy7-MAO，并在小鼠从麻醉中恢复15分钟后收集尿液进行荧光分析。尿液荧光测量显示，随着小鼠年龄增长，荧光团发射呈增加趋势。在注射后短时间间隔（15分钟）内，荧光信号对应于Cy7荧光团的形成，而非hemiCy7衍生物。在最年轻（2个月）和最年长（14个月）小鼠之间观察到发射强度的显著差异（约6.5倍），5和8个月大小鼠的值居中。这些结果表明Cy7-MAO足够灵敏，可通过尿液荧光检测与年龄相关的MAO水平差异。
尿液中的高效液相色谱-质谱分析显示，Cy7荧光团的数值随年龄增长而增加，从2个月大小鼠的1.5 ± 0.5%到14个月大小鼠的62.7 ± 7.1 %。高效液相色谱-质谱分析还表明，未水解的剩余Cy7-MAO探针也通过尿液排泄，对于2个月和14个月大小鼠，其值分别为注射探针的76.4 ± 5.9%和8.2 ± 5.7 %。中间年龄组（5和8个月）与2个月大小鼠相比，显示出Cy7逐渐增加，而Cy7-MAO减少。这些观察结果与以下事实一致：表现出较低MAO酶活性的年轻动物排泄更大比例的Cy7-MAO探针。相比之下，具有较高MAO活性的年老动物显示出Cy7-MAO广泛转化为荧光Cy7产物。这种年龄依赖的差异激活提供了一个清晰的动态窗口，证明该探针可以有效区分不同年龄的MAO活性变化。如先前研究所示，这些数据表明大量注射的探针在仅15分钟后就在尿液中排出（作为Cy7或Cy7-MAO），表明在组织中的滞留最少或通过替代途径清除，并确认肾排泄是主要的清除途径。
此外，为进一步证实上述研究中提示的肝脏在生理衰老中的作用，评估了不同年龄组肝脏中衰老标志物p16Ink4a（由Cdkn2a基因编码）的表达水平。观察到Cdkn2a水平随年龄增长而逐渐增加，在14个月大小鼠中表达显著，从而将观察到的Cy7-MAO激活与衰老表型联系起来。总体而言，这些结果证实了Cy7-MAO探针作为一种微创工具，用于检测衰老中与生物学相关的MAO依赖性差异的潜力，提供了超越静态基因表达分析的补充见解。
受上述结果启发，Cy7-MAO探针也在其他不同年龄的小鼠模型中进行了验证，例如衰老加速的SAMP8品系（2和8个月大）和自然衰老的C57BL/6品系（2和16个月大）。尿液分析显示，两种品系中荧光发射均随年龄显著增加。具体而言，在2个月和8个月大的SAMP8小鼠之间观察到荧光强度增加了约2.2倍，在2个月和16个月大的C57BL/6小鼠之间检测到增加了2.8倍。这些发现表明，MAO的年龄相关性增加在不同小鼠品系中是一致的，并且在自然衰老（BALB/cByJ和C57BL/6）和加速衰老（SAMP8）模型中均有观察到，突显了Cy7-MAO作为在体内检测年龄相关MAO变化工具的多功能性。
总体而言，这些结果证明了Cy7-MAO作为一种可靠且非侵入式的荧光探针，用于在体内监测MAO活性的潜在用途，这一点由年龄相关的MAO活性增加与尿液荧光之间的明确相关性所证实。
3 结论
在精准医学的背景下，一种有吸引力的方法是使用简单的检测系统从可获取的生物体液中检测生物标志物以指导医疗决策。实现这一目标的一种方法是设计处于“关闭”状态的探针，该探针可在体内被特定生物标志物转化为“开启”状态的高发射产物，并可经肾清除，从而允许通过简单技术在尿液中检测荧光。基于此概念，我们报道了一种荧光分子探针（Cy7-MAO），通过检测收集的尿液样本中的荧光，选择性检测MAO酶。MAO酶诱导弱荧光的Cy7-MAO探针发生氧化脱胺，生成高荧光的Cy7荧光团，该荧光团随时间推移进一步转化为同样具有荧光的hemiCy7。共聚焦研究证实了Cy7-MAO在HepG2细胞中体外检测MAO的能力，该细胞存在内源性MAO过表达。我们还提供了证据，表明尿液荧光与老年和年轻BALB/c小鼠体内MAO的相对水平相关。我们发现12个月大小鼠的尿液发射强度是2个月大小鼠的5.8倍。这与Maoa和Maob的相对mRNA表达水平直接相关，在年老小鼠的肝脏中明显更高。重要的是，生物分布分析证实，注射后，探针经肝脏和肾脏转运至膀胱，尿液排泄是主要的清除途径，在其他主要器官中检测到的荧光极少。这支持了尿液荧光主要反映肝脏相关MAO活性的结论。此外，Cy7-MAO还通过不同年龄BALB/c小鼠的尿液荧光捕捉到了MAO水平的渐进性年龄相关变化。同时观察到Cdkn2a水平随年龄增长而逐渐增加，从而将观察到的Cy7-MAO激活与衰老表型联系起来。此外，在其他小鼠品系（SAMP8和C57BL/6）中的验证证实，这种与年龄相关的荧光增加在不同遗传背景下是一致的，支持了该探针更广泛的适用性。总体而言，结果凸显了Cy7-MAO作为一种非侵入式工具的价值，用于监测衰老体内与生物学相关的、MAO依赖性变化，这是现有方法以前无法实现的。该探针为MAO相关改变提供了一个简单有效的读数，为研究与MAO水平升高相关的疾病提供了一种新方法，并为将MAO与年龄相关的可能病理背景联系起来开辟了道路。这种方法不仅为MAO失调提供了简单有效的读数，而且强调了肾清除型探针在实时评估多种代谢和病理状况方面更广泛的应用潜力。
