《Advanced Science》：Hierarchical Channeled Graphitized Nanoarchitecture as a Diagnostic Platform for Maternal Fever Warning
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本研究构建了一种新型层级多通道石墨化纳米材料HPGC-Z67，并成功开发为一种高效、快速的纳米诊断平台。该平台通过其独特的多级孔道结构和高石墨化度，显著提升了血浆N-糖捕获与检测效率，简化了传统（N-糖）糖组学分析的繁琐流程（相比传统方案节约约25分钟处理时间和约30元人民币/样本）。将其与质谱联用，从150例临床血浆样本中成功提取N-糖谱，并通过机器学习筛选出关键糖型标志物，实现了对硬膜外镇痛相关母体发热和非感染性发热的精准鉴别与早期预警。
引言
产时母体发热是分娩过程中的常见症状，其主要由两大因素引起。其一是广泛用于分娩镇痛的硬膜外镇痛可能导致的一种不良反应，即硬膜外相关母体发热（ERMF），这是一种非感染性炎症过程，影响约20%至30%接受硬膜外麻醉的女性。另一种更为严重的发热形式是绒毛膜羊膜炎相关发热（CAM），由细菌侵入羊膜腔引起的感染所致。CAM显著增加了新生儿早发型败血症、脑膜炎、长期神经系统后遗症以及母亲患子宫内膜炎和产后出血的风险。由于ERMF和CAM初期临床表现相似，准确、快速的诊断对于及时、适当的治疗至关重要。然而，目前的诊断主要依赖于连续的母亲白细胞计数和C反应蛋白水平，其敏感性和特异性均不足。因此，迫切需要开发新的诊断工具，以实现产时发热风险的准确预测和感染源的可信区分，从而促进精准临床干预并改善围产期结局。
先进的生物检测纳米材料因其易于制造和灵活适应性，正成为有前景的临床诊断平台。其中，糖组学比肽组学更紧密地与疾病进程相关，并且与下游代谢组学相比，糖组学的变化通常发生在疾病进展的更早期，为早期疾病检测提供了更大潜力。然而，尽管糖组学在疾病发展中具有重要意义，但由于其广泛的结构异质性、低丰度和复杂的预处理过程，很少被纳入大规模的临床诊断。因此，精心设计的先进纳米材料对于克服这些限制，并弥合疾病特异性糖链与其高通量诊断应用之间的差距至关重要。石墨化碳纳米材料因其与糖链之间的疏水效应、电子诱导偶极相互作用和电子重分配相互作用的能力，是用于未衍生化糖链研究最常用的材料。然而，传统的石墨化碳材料通常结构简单，需要与色谱联用，延长了分析时间并阻碍了其临床规模应用。因此，设计和构建一种集成了多尺寸孔结构和互连扩展通道的先进石墨化碳纳米结构，有望充分利用三维互穿孔结构来增强糖链保留并提高传质效率，从而满足大规模、高通量临床疾病诊断的需求。
HPGC-Z67的构建与表征
本研究通过整合硬模板、溶剂控制成核和高温煅烧的策略，设计并构建了层级多通道石墨化碳（HPGC-Z67）。该合成过程主要包括三个步骤：硬模板（单分散聚苯乙烯微球，PS）的制备、层级多孔MOF（HP-Z67）的构建以及高温石墨化。表征结果显示，HPGC-Z67保持了HP-Z67的晶体形态和大孔结构，这些大孔相互连接形成通道，促进了N-糖在HPGC-Z67结构内部的扩散和结合。
X射线衍射图谱分析证实了HPGC-Z67的成功石墨化，并在26.5°和42.3°处检测到对应于石墨化碳（PDF#41-1487）的（002）和（100）晶面的两个明显衍射峰。拉曼光谱中1350 cm?1处的D峰和1589 cm?1处的G峰进一步验证了石墨化碳的存在。值得注意的是，HPGC-Z67的ID/IG比为0.91，低于GC-Z67的0.96，表明HPGC-Z67具有更高的石墨化程度，更有利于N-糖的保留。氮气吸附/脱附等温线和孔径分布测试显示，HPGC-Z67保持了其前体MOF的介孔结构，并表现出IV型等温线特征，其孔径（4.0 nm）大于GC-Z67（3.7 nm）。这种层级多孔结构有利于N-糖在互连的多孔通道中扩散，同时阻挡大的蛋白质干扰物，增强N-糖识别的特异性。此外，HPGC-Z67的BET比表面积为371.4 m2g?1，总孔体积为0.28 cm3g?1，均超过了GC-Z67（分别为320.1 m2g?1和0.24 cm3g?1）。更大的比表面积和孔体积为N-糖的保留提供了充足的位点。
HPGC-Z67平台对N-糖的检测性能
使用卵清蛋白消化物作为糖标准品，对HPGC-Z67平台的N-糖检测性能进行了初步评估。组间和组内平行实验的结果表明，该平台展现出优异的重复性。通过与未石墨化的HP-Z67、ZIF-67以及石墨化的GC-Z67进行比较，发现只有石墨化后的材料（HPGC-Z67和GC-Z67）表现出显著的N-糖检测能力。得益于更高的石墨化程度和层级互连的多孔结构，HPGC-Z67产生的信号强度高于GC-Z67。
进一步比较了HPGC-Z67和GC-Z67对低浓度N-糖的富集和检测性能。结果表明，在富集的N-糖数量及其信号强度方面，HPGC-Z67均优于GC-Z67。特别是在超低浓度0.1 ng μL?1下，HPGC-Z67仍能检测到8个N-糖，而GC-Z67仅检测到2个。这种卓越的分析性能归因于更高的碳石墨化度改善了与N-糖的相互作用，更大的表面积提供了丰富的N-糖吸附位点，以及层级互连的多孔结构促进了N-糖在通道内的扩散和保留。
考虑到HPGC-Z67的分级通道结构具有通过尺寸排阻效应阻挡大分子干扰物的潜力，研究探索了其对更复杂样品的检测可行性。实验证明，即使在富含蛋白质的环境中，HPGC-Z67平台也能有效捕获和检测N-糖，而蛋白质信号几乎被基线掩盖，这验证了通过设计具有分级通道结构的石墨化材料来实现糖肽灵敏和特异性检测的策略。
对于大规模临床应用，简化、快速和易于操作至关重要。研究尝试基于HPGC-Z67平台改进N-糖释放方案，用直接离心和洗涤步骤取代传统的超滤步骤。结果表明，与传统的超滤过程相比，基于HPGC-Z67平台的方案显著减少了离心时间（从32分钟减少到仅6分钟），并降低了每个血浆样本约30元人民币的超滤管成本。更重要的是，直接离心方案在富集的N-糖数量和强度比方面均优于非超滤测定和传统超滤。最终，确定了最佳富集和检测条件为：15 μL血浆消化物与20 μL材料（10 μg μL?1）的比例，以及60分钟的孵育和洗脱时间。
HPGC-Z67平台的诊断模型优化
采用简化的流程方案和优化的检测条件，研究者使用HPGC-Z67平台从150个血浆样本中提取了N-糖谱。这些样本来自分娩前的孕妇，并经过了临床诊断，分为健康对照组（HC，n = 50）、ERMF组（n = 50）和CAM组（n = 50）。质谱数据处理后，共鉴定出71个N-糖，其中59个在三个组中均被检测到。这些N-糖中89.8%为杂合或复杂糖基化类型，10.2%为高甘露糖类型，且47.5%含有超过四个N-乙酰葡糖胺残基，显示出高度分支的特征。
为了确保N-糖特征筛选和预测诊断模型的可靠性，研究者对质量对照组进行了批次变异评估，证实技术变异性远小于生物样本间变异。随后，基于这59个N-糖，引入了逻辑回归（LR）、支持向量机（SVM）、随机森林（RF）和梯度提升（GB）四种机器学习模型进行分类性能评估。综合评估显示，梯度提升模型表现最佳。使用优化后的梯度提升模型，基于HPGC-Z67平台提取的N-糖对HC、ERMF和CAM队列进行了多元分类，各队列均获得了高AUC值。进一步的成对区分也在训练集和验证集中显示出高AUC值。这些结果证明，HPGC-Z67平台提取的血浆N-糖谱能够实现对CAM和ERMF的快速、精确早期预警和诊断。
基于HPGC-Z67诊断平台的精确产时发热诊断
基于HPGC-Z67提取的59个N-糖特征所展现出的高分类效能，研究者致力于筛选与分娩发热最密切相关的关键N-糖，特别是那些对于区分需要及时产前干预的CAM感染性发热至关重要的糖型。通过特征重要性评分和p值小于0.05作为筛选标准，分别从HC/发热组和CAM/ERMF组中筛选出关键N-糖特征。
0.05; *, p < 0.05; , p < 0.01;, p < 0.001;***, p < 0.0001. (i) The confusion matrix for predicting HC/CAM/ERMF based on Feature Set 3 in the training set.">
最终，筛选出5个关键N-糖特征用于区分HC/发热组（特征集1），以及另外5个关键N-糖特征用于区分CAM/ERMF组（特征集2）。特征集1在训练集和验证集中均成功实现了HC/发热组的分类。特征集2对CAM/ERMF组的分类也获得了显著的区分性能，尤其在验证集上达到了100%的准确性和特异性。这为实现产前手术孕妇不同病因发热的及时、精确预警提供了可能。
对这些筛选出的关键N-糖的表达水平进行分析后发现，在HC/发热预测中，多数关键N-糖特征在产时发热组中上调。在发热细分中，所有关键特征在CAM组中相对于非感染性ERMF均上调。糖型分析显示，大多数血浆岩藻糖基化和唾液酸化N-糖水平在发热组中升高。值得注意的是，岩藻糖基化N-糖与母体发热（包括感染性和镇痛诱导的发热）之间存在关联。有趣的是，两个岩藻糖基化N-糖特征（m/z 1793.65 和 m/z 2305.24）同时出现在HC/发热和CAM/ERMF分类模型中。进一步评估发现，m/z 1793.65的N-糖在HC和ERMF之间没有明显变化，但与CAM相比显著上调，表明其与炎症感染性发热密切相关；而m/z 2305.24的N-糖在ERMF中相对于HC和CAM明显下调，表明其与非感染性发热密切相关。这两个特征被指定为特征集3。令人惊讶的是，仅基于这两个潜在生物标志物（一个对感染性发热敏感，一个对非感染性发热敏感）的模型，能够同时区分HC、CAM和ERMF组，在训练集和验证集中分别获得了0.965和0.914的AUC值、86.7%和80.0%的准确率以及93.3%和90.0%的特异性。这些发现验证了感染性发热敏感和非感染性发热敏感的N-糖特征对于HC、CAM和ERMF同时诊断预测的高度有效性。
结论
本研究设计了一种层级多通道石墨化碳（HPGC-Z67）作为快速、灵敏的纳米诊断平台。通过精心的纳米结构设计，HPGC-Z67具有高比表面积、高石墨化度以及互连的分级通道等优势，能够增强N-糖在分级通道内的保留和扩散。此外，借助其灵敏的糖检测能力，HPGC-Z67纳米诊断平台能够简化实验流程，与标准方法相比，每个样本的处理时间减少约25分钟，成本降低约30元人民币。该平台展示了从150个临床血浆样本中进行高通量、可重复N-糖谱分析的强大能力。结合机器学习，研究者从获得的糖谱中筛选出包含八个关键N-糖的两个特征集。这些关键N-糖不仅能够准确区分发热与健康状态，还能区分感染性（CAM）和非感染性（ERMF）病因，在训练和验证队列中所有AUC值均超过0.95。值得注意的是，仅基于两个潜在生物标志物（一个感染性发热敏感，一个非感染性发热敏感N-糖）的模型，能够同时区分HC、CAM和ERMF，并获得了高AUC值。该HPGC-Z67纳米诊断平台为产时发热的精准早期诊断和及时临床干预提供了潜力，并将纳米诊断技术的范围扩展到了糖组学生物检测领域。
