《Advanced Science》：Sensing and Reprogramming Surface Receptor Activation With Synthetic Transcriptional Circuits
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这篇研究论文介绍了一种创新的合成受体信号诱导转录(RESIT)系统，旨在解决在细胞膜近端感知并重编程受体激活信号用于定制化细胞功能的挑战。该系统基于受体激活介导的裂解蛋白酶互补和膜锚定合成转录模块的释放，展现出模块化和通用性，可应用于多种转录因子和裂解蛋白酶。研究成功利用该系统检测了PIEZO1诱导和T细胞激活伴随的Ca2+内流、致癌性受体酪氨酸激酶(RTK)活性以及质膜附近的Ras激活，并进一步将其改造用于执行凋亡诱导、靶向蛋白降解和T细胞激活等治疗功能。这项工作为解析膜近端生化信号和重编程失调的受体激活用于治疗提供了新的强大工具。
RESIT系统的设计与原理
细胞依赖表面受体感知胞外信号并启动膜近端的信号传导，这对于细胞增殖、分化和生存至关重要。然而，设计能够感知并重编程受体活性以实现用户定义功能的合成基因回路仍具挑战性。针对这一难题，研究者开发了一种名为受体信号诱导转录(RESIT)的合成回路。该系统的核心设计基于受体激活介导的裂解蛋白酶互补以及膜锚定合成转录模块的释放，从而将膜定位的受体激活转化为预设的转录程序。
RESIT系统的基本结构包含两个膜定位的合成转录模块。每个模块包含一个N端膜定位结构域、一个蛋白酶切割位点(TCS)、一个截短的非活性DNA结合域(DBD)、一个裂解蛋白酶片段和一个相互作用域。当受体被激活时，两个相互作用域(IDa和IDb)的接近会导致裂解蛋白酶(例如烟草蚀纹病毒蛋白酶TEVp)的两个片段发生不可逆的互补组装。随后，活化的蛋白酶会切割其底物，使得两个被膜锚定的、截短的DBD发生稳定的同源二聚化，并释放出能够激活转录的合成模块。这种设计将膜近端的生化相互作用事件高效地转换成了可读的基因表达信号。膜锚定的设计具有显著优势：它将反应物限制在二维膜表面而非三维胞质体积内，从而提高了局部的有效浓度，加速了反应动力学，并增强了信号检测的灵敏度与空间选择性。
2+内流的RESIT系统示意图。受体激活后，IDa和IDb相互作用诱导裂解TEVp互补，导致膜锚定的转录调节因子重新组装和释放，从而诱导各种蛋白报告基因或效应因子的表达。(B) 对AP21967响应的RESIT系统示意图。">
研究者首先使用一个模型系统——由小分子AP21967诱导的FKBP与FRBT2098L之间的异源二聚化——来优化RESIT系统的通用部分。通过筛选不同截短程度的Gal4转录因子DBD变体，发现最优变体tGal4(65)能在AP21967诱导下实现高达103倍的荧光信号增强，同时背景极低。系统具有高度模块化特性：它被证明可适配多种裂解病毒蛋白酶，如李痘病毒蛋白酶(PPVp)和大豆花叶病毒蛋白酶(SbMVp)，以及来自不同转录因子(如Gal4、TetR和GCN4)的DBD结构域，且这些正交的DBD能够特异性激活其对应的报告基因。
感知Ca2+内流
Ca2+内流在机械转导、分化和免疫等众多生理过程中扮演关键角色。为了检测质膜附近的Ca2+信号，研究者对RESIT系统进行了改造，将相互作用域分别替换为钙调蛋白(CaM)和钙调蛋白结合肽M13。当Ca2+通过阳离子通道进入细胞后，会介导CaM与M13的结合，从而触发裂解蛋白酶互补和转录回路激活。
2+内流的RESIT系统设计。(A) 对Piezo1激活引发的Ca2+内流响应的RESIT系统示意图。Piezo1激活介导的Ca2+内流诱导CaM?M13结合，从而互补裂解TEVp以启动转录回路。">
该系统成功检测了由PIEZO1激动剂Yoda1诱导的Ca2+内流，在PIEZO1阳性的HeLa细胞中显示出强烈的荧光响应，且响应具有剂量依赖性。在PIEZO1阴性的HEK293T细胞中，只有在转染PIEZO1表达质粒后才会出现响应，证明了系统的特异性。此外，该系统还能检测由内质网Ca2+释放(如毒胡萝卜素TG诱导)以及组胺H1受体(H1R)激活所触发的Ca2+内流。值得注意的是，膜锚定版本的RESIT比胞质定位的版本具有更高的检测灵敏度，凸显了其膜近端信号检测的优势。
更为引人注目的是，该系统被成功应用于检测T细胞激活伴随的Ca2+内流。研究者将RESIT系统包装进慢病毒载体，转导至Jurkat T细胞中。当这些T细胞与表达不同水平HER2的肿瘤细胞在双特异性T细胞衔接器(BiTE，由HER2纳米抗体和CD3单链可变片段scfv组成)存在下共培养时，RESIT系统分泌的荧光素酶报告基因活性与T细胞的激活程度(通过CD69上调证实)呈正相关，且响应依赖于BiTE介导的特异性识别。这证明了RESIT系统能够将复杂的免疫细胞激活信号转化为可量化的转录输出。
感知RTK活性
受体酪氨酸激酶(RTK)的异常激活与多种癌症密切相关。为了探测RTK活性，研究者以表皮生长因子受体(EGFR)为模型，重新设计了RESIT系统。其中一个转录模块引入了与EGFR靠近的VAV1蛋白的SH2结构域，并连接一个底物肽基序(NPXY)；另一个模块则包含磷酸酪氨酸结合域(PTB)。当EGFR被激活时，其自磷酸化为邻近的NPXY基序提供了磷酸化位点，磷酸化的NPXY进而与PTB结构域结合，从而诱导蛋白酶互补和转录激活。
b)并介导其与PTB结构域(IDa)的相互作用，诱导裂解TEVp互补和转录回路启动。">
该RTK响应型RESIT系统在EGF刺激的HeLa细胞中显示出强烈的荧光信号增强。通过使用无法结合磷酸化底物的PTB突变体或突变的底物基序(NPXF)进行对照实验，证实了系统的特异性依赖于底物的磷酸化及其与PTB的结合。此外，SH2结构域对于将底物招募至EGFR附近以实现高效磷酸化至关重要。系统对不同细胞系(HEK293T、MCF-7、HeLa、SKOV3和A549)内源性RTK活性的检测结果，与通过蛋白质印迹(WB)测得的EGFR磷酸化水平一致。同样，膜锚定设计对于实现高信噪比至关重要，因为胞质版本的RESIT在EGF诱导下仅产生微弱的荧光增强。
感知Ras活性并评估抑制剂疗效
Ras是位于EGFR下游的关键小GTP酶，其突变与许多癌症有关。为了检测Ras活性，研究者将RESIT系统的相互作用域分别替换为Ras蛋白(缺失C端以允许膜锚定)和其效应蛋白Raf1的Ras结合结构域(Raf1)。激活的Ras与Raf1结构域结合，从而触发RESIT回路的激活。
a)与Raf1(IDb)相互作用，介导裂解TEVp互补以启动转录回路。">
该系统成功检测了HeLa细胞中EGF诱导的Ras活性上调。利用该系统评估不同Ras热点突变体(G12C、G12D、G13D、Q61L和S17N)的组成型活性，发现G12C、G12D、G13D和Q61L突变体即使在无EGF刺激下也表现出高基础活性，而S17N突变体则活性极低，这与文献报道一致。此外，该系统被用于评估Ras抑制剂的疗效。结果显示，MRTX1133能特异性抑制Ras G12D突变体的活性，而对其他突变体无效，证实了其等位基因特异性；而RMC-7977则能广泛抑制所有测试的Ras突变体活性，表明其是一种广谱抑制剂。这些实验证明了RESIT系统在活细胞中实时评估Ras突变体活性和筛选靶向疗法方面的潜力。
重编程致癌性RTK活性用于细胞特异性治疗
鉴于RTK的持续激活是许多癌症的标志，研究者进一步将RTK响应型RESIT系统改造为治疗性程序，用于特异性杀伤或调控高RTK活性的细胞。
首先，他们将报告基因替换为凋亡诱导蛋白hBax，构建了能诱导细胞凋亡的RESIT系统。在EGFR高表达的细胞(如A549、SKOV3)中，该系统成功诱导了显著的细胞凋亡(Annexin V阳性细胞比例升高)，而在低表达EGFR的细胞(如MCF-7、HEK293T)中则几乎没有影响，实现了基于RTK活性的细胞特异性杀伤。
其次，他们将报告基因替换为一种可分泌的双特异性溶酶体靶向嵌合体(LYTAC)，该分子由靶向EGFR的纳米抗体和靶向胰岛素样生长因子2受体(IGF2R)的计算设计肽Endotag2组成。在RTK活性高的细胞中，RESIT系统诱导LYTAC的分泌，进而介导细胞表面EGFR的内吞和降解。结果显示，在A549和SKOV3细胞中，EGFR降解效果最为明显，且依赖于Endotag2的存在。
最后，他们将报告基因替换为一种可分泌的双特异性T细胞衔接器(BiTE)，由EGFR纳米抗体和CD3 scfv组成。当表达该RESIT系统的肿瘤细胞(具有高RTK活性)与Jurkat T细胞共培养时，分泌的BiTE能桥接肿瘤细胞和T细胞，特异性激活T细胞，表现为CD69和IL-2的上调以及细胞间的密切接触。而仅分泌CD3 scfv的对照组则不能有效激活T细胞。这种设计展示了利用RESIT系统在肿瘤微环境中局部招募并激活T细胞进行免疫治疗的潜力。
讨论与展望
RESIT系统为感知膜定位受体激活并将膜近端信号重编程为预设的转录程序提供了一个通用平台。其模块化设计使其能够适配不同的DBD和裂解蛋白酶，并成功应用于检测Ca2+内流、RTK活性和Ras活性等多种生物学过程。更重要的是，该系统可被重编程以在特定细胞背景下执行凋亡、靶蛋白降解和免疫细胞激活等治疗功能，展示了其在基础研究和治疗开发中的广泛应用前景。该系统依赖于时间整合的转录进行信号放大，这与实时响应的荧光蛋白传感器不同，但可能对记录瞬态信号事件具有独特优势。未来，通过选择具有不同亲和力的相互作用对，可以调节系统的灵敏度。理论上，RESIT可以进一步扩展用于感知其他涉及蛋白质-蛋白质相互作用的受体信号通路。此外，利用已构建的正交转录因子，有望设计多重响应的RESIT系统，以实现对多种输入信号的逻辑控制。总之，RESIT系统的模块化和通用性有望极大扩展我们探究膜近端受体信号传导以及将失调的受体激活重编程为强大治疗工具的能力。
