编辑推荐：
微藻Tetradesmus obliquus在环境相关浓度6PPD下呈现双相剂量效应：低浓度（≤10 μg/L）通过激活脂质介导的适应反应及代谢重编程促进生长，高浓度（≥100 μg/L）抑制光合作用并转向生存导向的碳代谢，揭示亚致死分子响应机制对生态风险评估的关键作用。
刘玉婷|范琴|王斌|高强|陈毅|徐静|曲涵|齐德林|庞明月|王伟
中国教育部三峡水库地区生态环境重点实验室，重庆大学生态与环境学院，重庆400045
摘要
轮胎抗氧化剂N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基-p-苯二胺（6PPD）的广泛使用导致其在水生环境中普遍存在，从而带来显著的生态风险。然而，淡水微藻对环境相关浓度6PPD的分子效应和适应机制仍知之甚少。本研究采用多组学方法，结合蛋白质组学和代谢组学与生理生化分析，探讨了6PPD在8天静态暴露期间对Tetradesmus obliquus的全面影响。研究发现，在环境相关浓度（≤10 μg/L）下，6PPD具有促生长作用，浓度达到0.1 μg/L时生长促进效果最为显著（增幅为32.26%）；而在更高浓度（≥100 μg/L）下则表现出抑制作用。这些不同的反应与特定的分子机制相关。在0.1 μg/L浓度下，6PPD通过调控鞘脂和甘油磷脂代谢、增强EPS（胞外多糖）的产生以及调整氨基酸和嘌呤代谢途径来支持细胞结构和生长。在100 μg/L浓度下，6PPD诱导了一种以生存为导向的代谢状态，表现为光合作用、线粒体功能及膜稳态受损，并导致碳能量利用向淀粉和蔗糖代谢、戊糖磷酸途径及卡尔文循环中间产物的转化转移，表明细胞更倾向于维持生存而非进行结构修复和增殖。与以往研究中观察到的被动信号干扰或短暂应激反应不同，本研究揭示了一种主动的代谢策略，即通过脂质介导的适应和碳能量重新分配来实现藻类生存，强调了在新兴污染物生态风险评估中考虑亚致死分子反应的重要性。
引言
轮胎添加剂（如抗氧化剂和硫化剂）对提高轮胎加工效率和耐用性至关重要。这些添加剂会迁移到轮胎表面并渗透到各种环境介质中[1]，[2]，[3]，对多种生物产生毒性作用。其中最常用的抗氧化剂之一是P-苯二胺（PPDs），尤其是N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基-p-苯二胺（6PPD），因其出色的聚合物稳定性能和高产量而受到青睐[4]。2020年，中国的6PPD产量约为20万吨[5]，显示出其对制造业的重要贡献及其潜在的大规模环境释放风险。这种广泛的依赖性和持续使用导致6PPD在水生生态系统中普遍存在，其浓度常常超过其转化产物的浓度。现场监测数据显示，通过分析14种不同轮胎的洗脱液，中性水中的6PPD浓度范围为10至100 μg/L[6]。此外，在拜耳布伦斯比特尔工厂，生物废水处理厂（WWTP）进水口的6PPD最高浓度达到240 μg/L[6]。即使在处理后的出水和城市径流中，也检测到6PPD的存在，浓度分别为0.3-11.2 μg/L[7]和0.21-2.71 μg/L（中位数0.32 μg/L）[8]。相比之下，6PPD的毒性转化产物6PPD-醌（6PPD-Q）通常检测到的浓度较低。在德国某WWTP的进水中，6PPD-醌的最大浓度为0.052 μg/L[7]，而在径流和接收水中则达到2.4 μg/L[9]，[10]。然而，近期研究主要集中在6PPD-醌的环境风险上[1]，[11]，[12]，[13]，[14]，可能是因为其在超痕量水平下对银鲑具有较高的急性毒性（24小时LC50为95 ng/L）[9]，[10]，[15]。这种观点忽略了6PPD的“伪持久性”特性。尽管6PPD易降解[13]，但由于轮胎磨损颗粒的持续释放，其在排放源附近的暴露水平仍很高。因此，目前对转化产物的关注过多，而忽视了6PPD本身的影响，这需要更全面的生态风险评估。
人们对6PPD的担忧日益增加，因为它可能通过本身或其转化产物对水生生物构成威胁。现有研究已充分记录了6PPD对多种水生物种的负面影响。例如，急性暴露可导致斑马鱼出现严重的形态异常、行为障碍、生殖和发育毒性，96小时LC50为2.2 mg/L[16]。此外，6PPD对中国的特有物种Gobiocypris rarus（LC50为162-201 ng/mL）具有高度毒性，而6PPD-醌对Oncorhynchus mykiss（LC50为1.66-4.31 ng/mL）也极具毒性[17]。6PPD还会干扰Ceratophyllum demersum L的各种生理和生化过程，包括生长、光合作用和氧化应激[18]。环境相关浓度的6PPD还会导致浮游植物Eichhornia crassipes的光合色素减少和碳水化合物显著变化[19]。这些毒性研究主要集中在消费者（如鱼类和浮游动物）和大型植物上，而对构成食物网基础的浮游植物群落（如微藻）的影响研究不足。
微藻作为水生生态系统中的初级生产者，通过光合作用将光能转化为化学能，是水生生态系统的重要组成部分。它们不仅增加溶解氧水平以支持需氧生物，还是水生食物网的基础，在养分循环和能量传递中起着关键作用[20]。已有研究表明，新兴污染物会影响微藻的生长和光合作用性能。然而，这些变化可能伴随细胞大分子组成的改变，包括脂质、碳水化合物和细胞外聚合物物质，这些因素共同决定了藻类的营养价值[21]，[22]，[23]。微藻生长和大分子组成的变化可能通过营养级传递影响更高营养级的生态结构，从而可能引发食物网结构和生态功能的连锁反应[24]。鉴于6PPD的化学性质（包括其在微藻中的吸附和积累能力[25]，以及微藻通过酶促途径转化外源化合物的能力[26]，这些过程可能调节6PPD的毒性和生物利用度。因此，污染物引起的微藻代谢变化不仅会影响藻类的营养价值，还可能影响更高营养级的效应。这凸显了研究微藻对6PPD分子反应的重要性，这对于评估水生食物网中的潜在生态风险至关重要。
目前关于微藻暴露于6PPD的研究主要集中在高浓度效应上[25]，对环境相关浓度下的各种反应和机制了解有限。鉴于水生环境中浓度的动态变化，这一知识缺口尤为明显。在低浓度下，微藻可能表现出促生长反应（类似激素效应），即低剂量暴露促进生长，而高剂量暴露则产生抑制作用[27]。有限的研究指出，在暴露于污染物的浮游动物[28]和植物[29]中也存在激素效应，这与抗氧化防御机制、应激蛋白和代谢途径的激活有关。然而，6PPD在微藻中诱导的激素效应的分子和代谢机制仍大部分未被探索。
需要进一步研究以阐明不同浓度的6PPD如何影响微藻的生理反应，重点关注分子层面的变化。本研究中使用T. obliquus来检测其对6PPD暴露的生理和代谢反应，包括环境相关的低剂量和高剂量。实验详细检测了细胞生长和活性、光合色素和EPS的分泌、氧化应激指标以及细胞结构。为了深入理解分子机制，采用了蛋白质组学和代谢组学方法来分析表达谱和代谢途径，包括氨基酸、脂质和碳水化合物代谢。这项研究不仅为理解微藻与6PPD之间的激素效应提供了宝贵见解和有力支持，还揭示了微藻在环境相关浓度下的独特分子机制。
部分摘录
化学物质与藻类
6PPD（GC ≥ 98%，CAS编号793-24-8）购自中国上海的Aladdin公司。6PPD标准溶液用丙酮配制后，通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS，Agilent，型号1290-6475）进行分析（文本S1和图S1）。T. obliquus（FACHB-14）来自国家水生生物资源中心水生生物学研究所的淡水藻类培养库（FACHB），并在BG11培养基中于121 ℃下灭菌后进行预培养
6PPD对T. obliquus的激素效应
细胞密度作为生长的主要指标，在8天内逐渐增加，在0.1 μg/L浓度时达到最高值。在低于10 μg/L的浓度下，藻类密度比对照组增加了10.48%-32.26%，表明低浓度的6PPD可促进藻类生长。100 μg/L和500 μg/L处理组的初始生长速度与对照组相当，但在24小时后减缓。实验结束时，500 μg/L处理组导致最终细胞数量显著减少了16.13%
结论
在模拟的环境暴露情景下，环境相关浓度的6PPD对T. obliquus产生了双相的激素效应：在低浓度下促进生长，而在高浓度下则产生抑制作用。具体而言，0.1 μg/L的6PPD处理使生物量增加了32.26%，叶绿素a含量增加了25.27%，同时EPS分泌增强。这种适应状态与脂质代谢的上调有关
环境意义
N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基-p-苯二胺（6PPD）作为一种普遍存在的轮胎抗氧化剂，在水生环境中持续存在，并对淡水微藻产生影响，但其环境风险在分子层面尚未得到充分研究。本研究结合多组学和生理分析，探讨了Tetradesmus obliquus对环境相关6PPD浓度的反应，揭示了其双相激素效应及其潜在机制。它阐明了6PPD诱导的亚致死分子反应的作用机制
CRediT作者贡献声明
范琴：方法学、实验设计。刘玉婷：初稿撰写、可视化处理、方法学研究、数据分析、概念构建。高强：撰写、审稿与编辑。王斌：撰写、审稿与编辑。王伟：撰写、审稿与编辑、项目监督。庞明月：撰写、审稿与编辑。徐静：撰写、审稿与编辑。陈毅：撰写、审稿与编辑。齐德林：撰写、审稿与编辑。曲涵：撰写、审稿与编辑
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢国家自然科学基金（42377391）、青藏高原生态与农业国家重点实验室开放项目（2024-KF-05）、中央高校基本科研业务费（2025CDJZKPT-02）、青海大学生态学一流学科创新研究项目（2026-ST-05）以及重庆市重大技术创新与应用发展专项（CSTB2023TIAD-KPX0080）的支持
