利用普通脱硫弧菌UR1对受铀污染的地下水进行原位生物强化：机制研究、实验室验证及现场应用效果

本研究分离鉴定出新型铁硫循环细菌Aromatoleum evansii LY15，通过自维持的Fe-S氧化还原循环有效缓解矿物表面钝化，实现144小时内99.95%的硝酸盐去除，并协同降解低浓度 atrazine，揭示微生物介导的矿物活化机制及自由基和生物转化主导的有机污染物降解途径。

　　

刘燕|苏俊峰|白一涵|王月|张秦宇灿|徐子涵|张博文

西安建筑科技大学环境与市政工程学院，中国西安710055

摘要

农业废水通常含有硝酸盐（NO₃^?-N）和阿特拉津（ATZ），而由黄铁矿驱动的自养反硝化作用会受到表面钝化的阻碍。本研究报道了分离出Aromatoleum evansii LY15菌株，并展示了其自维持的铁-硫（Fe-S）氧化还原循环，该循环能够缓解表面钝化并保持电子流动，从而有效去除硝酸盐（NO₃^?-N）。通过使用可溶性Fe²⁺/Fe³⁺、硫代硫酸盐、硫酸盐和天然黄铁矿进行的批量实验发现，在所有测试的可溶性电子供体中，Fe²⁺与硫代硫酸盐的组合实现了最高的硝酸盐去除效率（80.86%）。4克/升（80目）的黄铁矿在144小时内几乎完全去除了硝酸盐（99.95%），并在中性pH条件下有效促进了实际废水样品中总磷的去除。透析实验表明，直接的菌体-矿物接触对于高效的电子交换至关重要。电化学分析显示电荷转移阻力显著降低，Fe-S氧化还原电流增强，证实了微生物介导的黄铁矿活化作用。次级铁-硫相（如Fe₃O₄、FeS、Fe₃S₄）和中间硫物种（S⁰/S_n^2-）的存在表明了动态的Fe-S循环。阿特拉津表现出浓度依赖性效应，浓度在0.5–1.0微摩尔时能够促进反硝化作用、细胞外电子转移和Fe-S循环。电子顺磁共振和质谱分析揭示了自由基途径（SO₃^·-、·OH）和生物转化是低浓度下超过95%阿特拉津去除的主要机制。总体而言，LY15菌株通过双向Fe-S循环缓解了黄铁矿的钝化，将硝酸盐去除与阿特拉津的降解耦合起来，为复杂农业废水的有效处理提供了一个实用范例。

引言

农业废水中的硝酸盐（NO₃^?-N）和持久性除草剂阿特拉津（ATZ）对水生生态系统和人类健康构成严重威胁，会导致富营养化和饮用水源污染[1]。然而，在单一处理过程中同时有效去除硝酸盐（NO₃^?-N）和阿特拉津具有挑战性。硝酸盐的去除通常需要还原条件，而阿特拉津的降解则依赖于氧化途径或特定的酶促转化[2]。因此，传统的处理过程通常针对氮化合物或有机农药设计，很少能在一步中同时高效去除这两种污染物。

由无机电子供体驱动的自养反硝化作为一种可持续的替代方案，避免了对外部有机碳的需求[3]。在无机供体中，特别是黄铁矿，已成为微生物还原硝酸盐（NO₃^?-N）的理想电子供体[4]。重要的是，与黄铁矿氧化相关的铁-硫（Fe-S）氧化还原反应（例如在矿物表面）也能生成活性氧（ROS）[5]。反应过程中产生的ROS可以同时降解有机微污染物（如农药），从而为同时去除硝酸盐（NO₃^?-N）和农药提供了有希望的途径[6]。

近年来，基于黄铁矿的自养反硝化及相关Fe-S耦合过程在碳限制系统中作为氮去除的策略引起了越来越多的关注[7]、[8]。然而，基于黄铁矿的系统的反硝化效率从根本上受到表面钝化的限制，这是一种普遍存在的地球化学过程，会阻碍电子转移并降低矿物表面的反应性[9]。传统的铁氧化反硝化细菌主要催化黄铁矿的氧化溶解，这一过程不可避免地会在矿物表面形成不溶性的Fe(III)（氧氢）氧化物（如针铁矿、赤铁矿）层[10]、[11]。这种“铁钝化层”作为物理和电化学屏障，保护了原始的黄铁矿核心免受进一步的微生物攻击和电子转移，从而导致反硝化作用过早停滞[12]。虽然微生物的硫循环可以促进反硝化，但往往无法完全缓解这种以铁为中心的钝化[13]。目前缓解黄铁矿表面钝化或重新激活钝化层的策略包括使用具有互补代谢功能的混合微生物群落，以及物理化学干预措施，如酸洗或电化学复活[14]、[15]、[16]。尽管这些方法可以部分缓解钝化，但它们通常需要特定的环境条件、较长的时间、较高的成本和潜在的二次污染[17]、[18]。

以往的研究主要集中在由混合培养物或只能催化单一氧化还原方向的菌株驱动的反硝化系统上（例如，仅铁或硫的氧化），其主要目标通常限于去除硝酸盐（NO₃^?-N）[19]、[20]。因此，尽管提出了Fe-S氧化还原循环的概念，但直接证据表明纯培养的单菌株能够在自养条件下独立驱动铁和硫的双向氧化和还原仍然很少[12]。具体来说，单个细菌是否能够维持自持续的Fe-S氧化还原循环以缓解黄铁矿的钝化，从而实现长期的电子流动，进而实现硝酸盐（NO₃^?-N）的去除和顽固有机微污染物的转化，仍然是一个未解之谜。这一知识空白阻碍了对机制的准确理解以及开发出功能可靠、性能稳定的生物修复系统。

本研究分离并鉴定了一种新的细菌菌株，并设计了一系列系统实验来：（i）使用各种可溶性铁和硫来源以及天然黄铁矿验证其双向Fe-S氧化还原活性，并量化该耦合循环对反硝化性能和可持续性的提升；（ii）阐明LY15菌株如何通过微生物-矿物界面来调节自维持的Fe-S循环以缓解黄铁矿表面钝化；（iii）评估该系统在阿特拉津压力下的抗逆性和同时去除污染物的能力。从这项工作中获得的机制见解有望为开发无需有机碳的耐钝化生物反应器提供基础，为处理同时含有硝酸盐（NO₃^?-N）和农药的农业废水提供一种可行的方法。

实验设计

铁-硫循环细菌的富集与分离

这些功能性微生物是从西安第四污水处理厂的活性污泥中通过使用Fe²⁺和硫代硫酸盐（S₂O₃^2-）作为电子供体的厌氧培养基中富集得到的。详细程序和培养基组成见文本S1。

LY15菌株的鉴定

根据16S rRNA基因测序和系统发育分析，LY15菌株被鉴定为Aromatoleum evansii（图1a）。详细的菌株鉴定程序和结果见文本S2。

评估铁和硫贡献的实验设计

单独添加Fe²⁺/Fe³⁺

脉冲添加Fe²⁺对LY15菌株的反硝化性能和Fe循环行为有显著影响，20毫克/升（20 mg/L）的添加量被证明是最优的（图2a）。此时实现了最高的硝酸盐去除效率（53.80%）和ATP浓度（75.9 nM），显著优于不含Fe²⁺的对照组。值得注意的是，在72小时后，硝酸盐（NO₂^?-N）几乎完全被还原。相比之下，30毫克/升（30 mg/L）的Fe²⁺产生了抑制作用，包括硝酸盐去除速度减慢和硝酸盐（NO₂^?-N）的积累（图S1）。

结论

本研究分离并鉴定了Aromatoleum evansii LY15菌株，并证明了其能够同时氧化/还原铁和硫，从而建立了自维持的Fe-S循环。该循环持续缓解了黄铁矿的表面钝化，保持了稳定的电子流动，实现了高效的自养反硝化。在自养、中性pH条件下（黄铁矿剂量为4克/升，粒径80–200目），该系统在144小时内实现了超过99%的硝酸盐去除。

环境影响

农业废水中含有有害水平的硝酸盐和顽固的除草剂阿特拉津，会导致富营养化和饮用水源污染。本研究展示了一种可持续策略，其中Aromatoleum evansii LY15菌株在黄铁矿上驱动了自维持的Fe-S氧化还原循环。这一过程缓解了严重限制黄铁矿基自养反硝化的表面钝化，并生成了活性自由基（如·OH和SO₃^·-），从而促进了...

CRediT作者贡献声明

张博文：验证。 张秦宇灿：方法学、研究。 徐子涵：数据分析、审稿与编辑、监督、资金获取。 白一涵：写作、审稿与编辑、可视化、监督。 刘燕：初稿写作、数据分析、数据管理。 苏俊峰：研究、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究部分得到了国家自然科学基金（NSFC：编号52270167和52400013）、陕西省重点科技创新团队（2023-CX-TD-32）和陕西省杰出青年科学基金项目（编号2025JC-JCQN-019）的支持。作者感谢西安建筑科技大学仪器分析中心的张新伟和宋芳提供的宝贵帮助。