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开发新型近红外荧光探针DCI-2a用于同时检测Hg2?和ONOO?，验证其监测氧化应激及评估解毒药物效果的应用。
张鹏程|赛志鹏|王晓宇|徐静静|尤凯|杨志军|葛春波
新乡医学院基础医学科学学院，中国新乡，453003
摘要
作为一种高毒性重金属，Hg2?可以通过食物链在人体内积累，导致多系统损伤，并引发过氧亚硝酸盐（ONOO?）的生成。ONOO?的失衡与多种疾病相关，因此有必要准确监测这两种物质以及生物系统中由Hg2?引起的氧化应激状态。近红外（NIR）荧光探针是理想的工具，但现有的大多数探针只能单独检测Hg2?或ONOO?，多功能探针相对较少。在这项研究中，开发了一种NIR荧光探针DCI-2a。它使用二氰异佛尔酮作为荧光团，二甲基硫磷酸酯作为识别基团。DCI-2a可以与Hg2?反应生成中间产物，并与ONOO?反应生成DCI-OH。在响应过程中，它具有较大的斯托克斯位移（174 nm和191 nm），以避免背景干扰。此外，该探针不仅可用于检测环境、食物和植物中的Hg2?，还可以动态监测细胞和斑马鱼中的Hg2?和ONOO?。此外，它还用于急性汞暴露的小鼠模型中，以验证Hg2?引起的氧化应激。DCI-2a还初步评估了解毒药物对Hg2?中毒的有效性，为分析Hg2?的毒性机制及开发相关的治疗和预防策略提供了实验基础。
引言
健康与福祉在许多方面是内在联系的，相互影响和支持。然而，人类活动的增加加剧了环境的重金属污染，这引起了广泛关注[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。其中，汞是一种典型的高毒性重金属污染物，在自然界中广泛存在[7]、[8]。汞（Hg2?）离子主要来自工业废水排放、燃煤发电厂、电子设备等，在大气、水体和土壤中迅速积累[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。此外，汞可以通过植物和各种微生物进入食物链，最终在人体内积累，导致慢性中毒，损害多个系统和器官[14]。例如，体内过量的Hg2?不仅会干扰胚胎的正常发育，导致胎儿畸形或功能缺陷[15]、[16]；还会破坏内分泌系统的激素平衡，影响生殖器官的生理功能，并抑制免疫系统的免疫反应[17]、[18]。同时，肺组织会因Hg2?的刺激而受到炎症损伤，肾脏（作为代谢器官）会因Hg2?排泄负担增加而出现功能障碍[19]、[20]，心血管和脑血管系统会受到血管硬化、血压异常等问题，肝脏、胃肠道和脑神经组织也会在Hg2?的毒性作用下遭受严重损伤，如细胞坏死和功能障碍[21]、[22]。因此，Hg2?污染对人类健康构成了全面且不可逆的威胁。
相关研究表明，Hg2?的强亲电性是其毒性的原因[23]。它会与蛋白质等生物分子中的活性基团（如巯基、氨基和羧基）紧密结合，从而干扰生理过程，引发氧化应激，并导致线粒体功能障碍[24]、[25]。更重要的是，Hg2?的强亲电性还可以直接损伤DNA链，导致链断裂，并促进活性氧（ROS）和活性氮物种（RNS）的大量产生[26]、[27]、[28]、[29]。当细胞内Hg2?浓度升高时，通常会触发一氧化氮（NO）和超氧阴离子（O??）的爆发，它们迅速反应生成过氧亚硝酸盐（ONOO?）[30]、[31]、[32]、[33]。这种物质的半衰期短，活性高，在体内的含量低，但其失衡与多种疾病的发生密切相关。例如，中风、心脏病、神经退行性疾病、心血管疾病、炎症和癌症（图1
）[34]、[35]、[36]。因此，开发高效、灵敏且生物相容的技术方法对于准确监测生物系统（如细胞、组织、活体和植物）中Hg2?的实时浓度和分布特征、追踪ONOO?水平的变化，甚至量化Hg2?引起的氧化应激的整体状态至关重要。
在现代生物医学研究领域，荧光探针技术因其显著的优势而被广泛应用，包括高成本效益、优异的生物相容性、高检测灵敏度以及能够快速实时捕获生物系统中活性物种的动态信息[37]、[38]、[39]。当与高分辨率荧光成像技术结合时，它成为深入研究生物体内关键活性物种生理功能的关键工具——使得对参与酶促反应和信号转导的钙和锌离子、调节能量代谢和细胞信号通路的氯离子和磷酸盐离子、与疾病进展相关的蛋白酶和激酶，以及维持细胞氧化还原平衡的活性氧（ROS）、活性硫物种（RSS）和活性氮物种（RNS）的研究成为可能[40]、[41]、[42]、[43]。此外，发射波长在650至900 nm范围内的近红外（NIR）荧光探针利用了NIR的优势，如更深的组织穿透力、较少的生物背景荧光干扰和较低的光毒性，非常适合体内荧光成像，因此受到了研究人员的广泛关注[44]、[45]、[46]。此外，荧光探针还应具有较大的斯托克斯位移。这是因为较大的斯托克斯位移可以减少由于吸收光谱重叠引起的荧光吸收串扰，从而提高检测和分析的灵敏度[47]、[48]。
目前，用于检测Hg2?或ONOO?的探针仍存在局限性：大多数荧光探针只能单独检测Hg2?或ONOO?，而能够同时分层检测Hg2?和ONOO?的探针报道较少。此外，能够监测Hg2?引起的氧化应激和ONOO?波动的多功能探针仍然是研究热点之一。文献中报道的大多数双响应探针的响应时间过长，这限制了它们捕捉ONOO?的爆发生成和Hg2?在生物体内的瞬时积累等动态过程。这种动态捕获能力的限制尚未解决，限制了这些探针对生物病理过程的精确追踪。（表S2）基于此，设计和合成一种用于检测Hg2?引起的氧化应激并追踪ONOO?变化的多功能近红外荧光探针尤为重要，以填补这一研究领域的空白。
最后，我们基于分子内电荷转移（ICT）效应开发了一种荧光探针DCI-2a，通过分析不同的信号模式实现了Hg2?引起的ONOO?生成的实时监测和成像。该荧光探针使用二氰异佛尔酮作为荧光团，二甲基硫磷酸酯作为识别基团来响应Hg2?，Hg2?被氧化为中间产物。进一步加入ONOO?后，中间产物转化为DCI-OH。同时，荧光探针也可以直接与ONOO?反应生成DCI-OH（图1）。值得注意的是，该探针在响应Hg2?、Hg2?+ONOO?和ONOO?时表现出较大的斯托克斯位移，避免了背景荧光和其他因素的干扰。通过优化识别单元的结构，DCI-2a将ONOO?的响应时间缩短至40秒，将Hg2?的响应时间控制在24秒，从而能够准确捕捉生物分子的瞬时变化。此外，该探针不仅成功实现了对环境、食物和植物中Hg2?的准确检测，还进行了细胞和斑马鱼中Hg2?和ONOO?的动态研究，验证了Hg2?引起的氧化应激过程中ONOO?的生成。我们还将该探针应用于急性汞暴露小鼠模型的体内成像，以验证Hg2?引起的氧化应激。更重要的是，我们还使用细胞和斑马鱼对Hg2?中毒的解毒药物进行了初步研究。总之，这种荧光探针的开发为深入理解Hg2?的毒性机制提供了实验基础，阐明了由其引起的各种疾病的生物机制，并制定了针对性的治疗药物和预防干预策略。
材料与仪器
实验中使用的所有材料和仪器均在支持信息中进行了描述。
探针的合成及其表征
DCI-OH的合成：使用无水乙醇（20 mL）作为反应介质。反应原料为2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-亚烯)丙二腈（372 mg，2 mmol）和4-羟基苯甲醛（244 mg，2 mmol），催化剂为哌啶（200 μL）。反应混合物回流10-12小时。通过薄层色谱（TLC）监测反应进度。
设计与合成
如图2所示，本研究通过两步反应合成了用于检测Hg2?和ONOO?的DCI-2a。探针分子中的二氰异佛尔酮部分具有强近红外发射、显著的斯托克斯位移和优异的细胞渗透性。二甲基硫磷酸酯段响应Hg2?和ONOO?，最终生成具有强分子内电荷转移（ICT）效应和显著荧光信号增强的DCI-OH。
结论
在这项研究中，成功设计并合成了一种基于二氰异佛尔酮骨架和二甲基硫磷酸酯响应单元的荧光探针DCI-2a。它通过分析不同的信号模式实现了对Hg2?和ONOO?的特异性检测。使用1H NMR、13C NMR、MS和密度泛函理论（DFT）计算研究了DCI-2a的结构和响应机制。DCI-2a表现出优异的光谱性能：Hg2?和ONOO?的检测限
环境影响
汞（Hg2?）是一种高毒性重金属，在环境和生物体内积累，造成严重的健康风险。本研究介绍了一种新型近红外荧光探针DCI-2a，它能够在环境样品、食物、植物和斑马鱼中同时检测Hg2?和过氧亚硝酸盐（ONOO?）。该探针不仅监测Hg2?污染，还能可视化Hg2?引起的氧化应激，为环境监测和食品安全提供了强大的工具
CRediT作者贡献声明
尤凯：验证、监督、方法学。徐静静：形式分析、概念化。杨志军：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、资金获取。葛春波：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、资金获取。张鹏程：写作 – 初稿撰写、软件、项目管理、数据管理。葛春波：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了河南省自然科学基金（252300423182，252300421393）和河南省高等学校重点科研项目（23A150024）的资助。
