《GLIA》：Neuronal Activity Promotes Node-Like Cluster Assembly Prior to Myelination and Remyelination in the Central Nervous System
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这篇综述性文章揭示了神经元活性如何通过调节钠通道亚型Nav1.1的表达，在发育和修复过程中促进郎飞结前体（即节点样簇，node-like cluster）的形成。该机制不仅是活动依赖性（再）髓鞘化的重要中间步骤，而且为理解神经可塑性、网络精细化以及多发性硬化症等脱髓鞘疾病的修复提供了新视角。
引言：理解节点样簇的生物学意义
在神经系统中，髓鞘包裹轴突以实现快速的跳跃式传导，郎飞结则是未包髓鞘、富含电压门控钠通道（Nav）的关键兴奋区域。传统观点认为郎飞结与髓鞘形成同时组装。然而，近年研究表明，在中枢神经系统发育和修复的髓鞘沉积之前，一种被称为“节点样簇”（node-like clusters）或“前结”（prenodes）的结构可以预先形成。这些结构对应于未被副结或髓鞘包绕的孤立节点标记簇，已在多种神经元亚型（如海马GABA能神经元、小脑浦肯野细胞和视网膜神经节细胞）的轴突上被描述，并在斑马鱼、小鼠、大鼠和人类中均有发现。在功能上，节点样簇已被证明可以加速轴突传导速度，并参与半结和成熟郎飞结的组装，引导其邻近区域的髓鞘形成起始。神经元活性已知在诱导发育性髓鞘化以及病理条件下调节（再）髓鞘化中起关键作用。然而，其如何影响轴突微域组织尚不清楚。本研究旨在探究神经元活性是否调控髓鞘沉积前节点样簇的组装。
结果1：神经元活性调控GABA能神经元轴突上节点样簇的形成
在海马混合培养体系中，节点样簇首先在体外培养约14天（DIV）时在GABA能神经元亚群上被观察到。为了评估神经元活性是否调节其形成，研究团队通过AAV转导，在神经元中表达DREADDs受体hM3D(Gq)-mCherry（激活）或hM4D(Gi)-mCherry（抑制），并加入其配体N-氯氮平（CNO）。结果显示，通过hM4D(Gi)-mCherry抑制神经元活性导致具有节点样簇的GAD+mCherry+神经元比例小幅但显著降低；而通过hM3D(Gq)-mCherry激活神经元活性则导致该比例增加25%。这表明神经元活性在体外促进GABA能神经元中节点样簇的组装。
为了确认神经元活性的直接作用，研究使用了河豚毒素（TTX）阻断动作电位的产生和传播。在混合海马培养物和用少突胶质细胞条件培养基（OCM）处理的纯化神经元培养物中，TTX均导致具有节点样簇的GABA能神经元比例大幅下降。这表明神经元活性可以直接调节神经元的内在特性来调控节点样簇的形成。
进一步的研究探讨了兴奋性谷氨酸能信号的作用。使用谷氨酸受体拮抗剂（如红藻氨酸、NBQX、APV）处理，可导致混合培养和OCM处理培养物中的节点样簇组装显著减少。值得注意的是，在纯化神经元培养物中，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）的添加可以部分挽救TTX引起的节点样簇组装减少，而AMPA/海人藻酸受体激动剂则不能。这些数据表明NMDA受体在神经元自主调节节点样簇组装中起主要作用。
结果2：谷氨酸能信号调控特定节点蛋白的表达
节点样簇含有郎飞结的主要标记物，如Nav通道（Nav1.1、Nav1.2，Nav1.6表达稀少或缺失）、β1Nav和β2Nav亚基、神经束蛋白186（Nfasc186）、神经元细胞粘附分子（NrCAM）和锚蛋白G（AnkG）。研究团队量化了在对照和经红藻氨酸（KYN）处理的条件下，GABA能神经元中各种节点蛋白的表达情况。结果发现，虽然β2Nav、Nfasc和Kv7.2在绝大多数GABA能神经元中均有表达，但表达Nav1.1、β1Nav和Kv3.1b的GABA能神经元比例在KYN处理后显著下降。逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）进一步证实，在纯化神经元培养物中，KYN处理导致<i>Scn1a（编码Nav1.1）和<i>Scn1b（编码β1Nav）表达显著降低，而<i>Scn2a（编码Nav1.2）表达无变化。此外，NMDA处理有上调<i>Scn1a和<i>Scn1b表达的趋势。这些结果表明，谷氨酸能输入可通过NMDA受体特异性调节GABA能神经元中某些节点蛋白的表达。
结果3：Nav1.1是节点样簇高效组装所必需的
在所有GABA能神经元的节点样簇中，Nav1.1均被一致检测到。为了评估Nav1.1是否必要，研究团队设计了两种靶向<i>Scn1a的miRNA（miR254和miR947），并与对照miRNA和靶向<i>Scn2a的miRNA（miR215）进行比较。在GABA能神经元中表达miR254或miR947，导致Nav1.1蛋白表达缺失，并伴随具有节点样簇的GABA能神经元比例大幅下降（分别下降45%和61%）。而靶向<i>Scn2a的miR215则不影响节点样簇的形成。使用AnkG标记量化节点样簇也得到了一致的结果。这些结果证实，Nav1.1是节点样簇高效组装所必需的，并且其作用具有特异性。综上所述，神经元活性可能通过谷氨酸能输入（特别是NMDA受体激活）调节Nav1.1的表达，进而影响节点样簇的形成。
结果4：神经元活性调控小脑发育髓鞘化前的节点样簇组装
节点样簇不仅限于海马GABA能神经元，在小脑浦肯野细胞发育性髓鞘化过程中也短暂存在。为了验证神经元活性调节节点样簇的形成是否具有普遍性，研究团队利用小脑器官型切片培养，通过DREADDs和光遗传学两种方法调节浦肯野细胞的活性。在髓鞘化起始时（3 DIV），通过CNO激活表达hM3D(Gq)-mCherry的浦肯野细胞，或通过470纳米光刺激表达通道视紫红质2（ChR2）的浦肯野细胞，均能显著增加具有节点样簇的浦肯野细胞比例。后续实验进一步证实，这种神经元活性的增强在一天后也促进了浦肯野细胞轴突的髓鞘化。此外，用KYN抑制谷氨酸能信号也导致了浦肯野细胞中Nav1.1表达减少和节点样簇组装小幅但显著下降。这些结果支持了体外研究的发现。
结果5：神经元活性调控修复过程中的节点样簇组装
利用溶磷脂酰胆碱（LPC）诱导小脑器官型切片脱髓鞘，可以研究自发性髓鞘再生。在髓鞘再生起始时（10 DIV），通过DREADDs或光遗传学方法增强神经元活性，均能显著增加具有节点样簇的浦肯野细胞比例。这表明，在修复过程中，神经元活性同样能够促进节点样簇的组装，与发育性髓鞘化过程中的观察结果类似。
结果6：神经元活性促进体内脊髓（再）髓鞘化中的节点样簇重组装
研究团队还在成年小鼠脊髓背索的局灶性LPC脱髓鞘模型中，探究了神经元活性对节点样簇的影响。通过逆向AAV在发出下行投射的脊髓上神经元中表达hM3D(Gq)-mCherry或hM4D(Gi)-mCherry，并在脱髓鞘峰值后（7.5天）腹腔注射CNO激活受体。结果显示，激活hM3D(Gq)受体以增强神经元活性，导致病变内节点样簇密度增加1.4倍；而激活hM4D(Gi)受体以抑制神经元活性，则导致节点样簇密度降低31%。这些结果证实，在体内修复过程中，神经元活性同样促进节点样簇的组装。
讨论与展望
本研究证明，从体外到体内模型，神经元活性均可调节多种神经元亚型在髓鞘形成前的节点样簇组装，并且在髓鞘再生过程中也存在类似的调节机制，表明这可能是节点样簇组装的普遍特征。其机制涉及神经元内在特性的直接调控，谷氨酸能信号（特别是NMDA受体）通过上调<i>Scn1a和<i>Scn1b的表达，从而影响其编码的Nav1.1和β1Nav蛋白水平，而Nav1.1对于节点样簇的高效组装至关重要。这一细胞自主机制可能与已知的参与节点样簇化的胶质细胞分泌因子产生协同作用。
神经元活性依赖性节点样簇组装可能参与发育过程的多个方面，包括神经元生理和神经网络建立。由于节点样簇化主要发生在随后将被髓鞘化的神经元上，并且节点样簇参与成熟郎飞结的形成并可能引导髓鞘沉积，因此节点样簇组装可能是活动依赖性髓鞘化的一个中间步骤。在脱髓鞘疾病如多发性硬化症中，节点样簇同样存在于髓鞘再生斑块中。本研究表明，神经元活性在髓鞘再生前也能促进节点样簇组装。可以推测，节点样簇可能通过定义髓鞘再生的模式，参与脱髓鞘后的修复过程。总之，神经元活性通过支持节点样簇的组装，进而调节轴突传导并引导髓鞘沉积起始，这可能有助于在发育过程中神经网络的正确建立，以及在发育性髓鞘化、可塑性和髓鞘再生过程中对髓鞘化的调节和模式形成。
