褪黑素通过调节氧化还原状态和钾离子（K+）的稳态来减轻锂（Li）对小麦的毒性作用

锂污染导致小麦生长受阻和氧化应激，褪黑素通过抑制ROS生成、调节钙信号传导、调控钾离子通道和质子泵活性协同缓解毒性。

　　

瓦卡斯·乌德·丁·汗（Waqas ud Din Khan）|雷王（Lei Wang）|邢泽明（Zeming Xing）|谢尔盖·沙巴拉（Sergey Shabala）|莫欣·坦维尔（Mohsin Tanveer）

中国科学院新疆生态与地理研究所干旱地区生态安全与可持续发展重点实验室，中国乌鲁木齐

摘要

农业土壤中的锂（Li）污染对环境构成了严重威胁，通过诱导氧化应激和破坏营养平衡来抑制作物生长。锂离子（Li?）不仅与钾离子（K?）竞争吸收，而且锂诱导的活性氧（ROS）积累可能通过对ROS敏感的钾离子外排通道触发大量钾离子的流失，从而导致细胞代谢活动严重紊乱和程序性细胞死亡。褪黑素（Melatonin，简称Mel）已被发现是一种潜在的生物胁迫缓解剂，但其在中毒条件下调节ROS水平和钾离子转运的作用尚未得到充分研究。本文采用了一种综合方法，结合非侵入性微电极离子通量测定、共聚焦成像和qPCR分析技术，证明Mel通过以下几种机制缓解了锂对小麦中钾离子的流失：（1）抑制NADPH氧化酶（RBOH）产生的ROS同时增强抗氧化活性；（2）通过调节钙离子-ATP酶（ACA/CAX）和CBL/CIPK蛋白来调节钙离子信号通路；（3）下调钾离子外排通道GORK并上调钾离子内流转运蛋白（HAK5、AKT1）以恢复钾离子的保留；（4）调节质膜上的H?-ATP酶活性。我们的研究结果表明，Mel同时调节ROS和钾离子的平衡，从而提高了小麦对锂的耐受性，为受锂污染土壤中的可持续植物修复和安全作物生产提供了重要见解。

引言

2010年至2021年间，锂的产量增长了295%，主要来自电池制造（占全球使用量的74%）、陶瓷（14%）和润滑剂（3%）[1][2]。环境中的锂含量正在上升，地下水中锂浓度达到1500 mg/L，瓶装水中的锂含量可高达5460 μg/L [3]。全球土壤中的锂积累量各不相同，范围从0.08 mg/kg到92 mg/kg，这取决于不同的地质和人为因素 [4][5][6][7]。锂在土壤中的高迁移性和对作物的生物可利用性引发了人们对食物链中生物累积和人类健康影响的担忧，突显了农业系统研究中的这一关键空白 [9][10]。 从生理学角度来看，锂是非必需元素，其对植物的影响强烈依赖于浓度 [10][11][12][13][14][15]。例如，在Apocynum venetum和Apocynum pictum中，锂氯酸盐（LiCl）暴露会降低种子发芽率、减少叶绿素含量和气孔导度（从而降低植物干重），叶片中的锂积累量可高达200 mg/kg [11][13]。荞麦对锂的敏感性更高，其EC50值仅为47 ppm [14]；而在玉米和向日葵中的实验表明，50 mg/kg的锂会显著降低地上部生物量并增加脂质过氧化，表明膜受到严重氧化损伤 [15]。然而，尽管小麦是全球主要粮食作物之一，但对其在锂胁迫下的生理和分子反应仍知之甚少，这成为食品安全研究中的一个关键空白。 鉴于锂（Li?）和钠（Na?）具有相似的物理化学性质 [8]，本研究借鉴了盐（NaCl）胁迫对钾离子（K?）平衡影响的已有研究结果来推断锂胁迫的机制。在盐胁迫下，细胞质中的钾离子浓度对细胞命运至关重要 [16]，而钾离子的保留是耐盐性的关键特征 [16][17][18]；小麦似乎也是如此 [18]。在盐胁迫下，钠离子的快速内流会使膜去极化，进而通过激活GORK通道诱导钾离子外排 [19]。然而，外源施用的褪黑素（Mel）在盐胁迫和镉胁迫下显著减少了根细胞和叶肉组织中的钾离子外排 [20][21]。这些发现能否推广到锂离子胁迫的情况？如果可以，其背后的机制是什么？ 此外，虽然已经建立了Mel对盐胁迫和重金属胁迫的耐受性机制，但锂离子的毒性带来了不同的生理挑战。由于锂离子的离子半径与钾离子相似，它直接与钾离子的吸收竞争，通过GIPC鞘脂干扰钙离子信号通路，并引发独特的氧化和离子损伤 [22][23]。然而，目前尚不清楚Mel在锂离子胁迫下的保护作用仅仅是其在盐/镉胁迫下的功能的延续，还是涉及锂离子特异性转运和信号传导的调整。 锂离子的毒性还会引发过量的ROS产生，导致脂质过氧化速率增加（丙二醛含量升高）[24]。植物通过酶类抗氧化剂（SOD、POD、CAT、APX）和非酶类化合物（谷胱甘肽、抗坏血酸）来减少ROS的产生，但其效果因植物种类和锂剂量而异 [24][25][26]。虽然传统的观点认为持续的ROS清除系统能够赋予植物耐受性，但较高的抗氧化活性与耐盐性关联度不高，且可能掩盖胁迫信号 [27]。因此，在ROS清除和ROS产生之间保持平衡至关重要 [27]。然而，在盐胁迫下，过量的ROS产生会通过激活ROS激活的非选择性阳离子通道导致钾离子外排 [27]。因此，减少盐胁迫下的钾离子外排不仅与GORK通道的激活有关，还需要综合策略。在这种情况下，Mel可能作为一种多效信号分子发挥作用，降低ROS水平并减轻其对离子平衡的负面影响 [28]。此外，Mel还能上调抗氧化酶活性，增加次生代谢产物的积累，并通过肽生物合成促进金属螯合，从而在重金属和盐胁迫下维持氧化还原状态 [20][29]。然而，这种调节对钾离子平衡的具体影响仍有待研究，尤其是在锂胁迫条件下。 钙离子（Ca2?）作为一种普遍存在的第二信使，在响应激素和环境胁迫时协调信号网络 [30]。在盐胁迫下，细胞质中的钙离子波动不仅对于感知离子失衡至关重要，而且对于恢复钾离子平衡也必不可少。例如，盐诱导的钙离子信号会激活CBL-CIPK复合体，进而调节SOS1（Na?/H?反向转运蛋白）等转运蛋白，调节钾离子通道活性，以防止钠离子毒性并维持钾离子/钠离子平衡 [31][32][33][34][35][36]。这种相互作用确保了钙离子信号在离子和渗透适应中的核心作用。褪黑素已被证明是胁迫条件下钙离子动态的关键调节因子。在拟南芥中，褪黑素促进钙离子外排并上调液泡中的H?/Ca2?反向转运蛋白（如CAX3），有助于ABA诱导的种子休眠期间的钙离子平衡 [37]。在盐胁迫下，褪黑素增强呼吸爆发氧化酶同源物（RBOHs）、CBL/CIPK网络和钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）的表达，从而改善钾离子的保留和耐盐性 [38]。此外，褪黑素还上调钙调蛋白样蛋白（CMLs）和其他钙离子响应基因（如CNGCs、CAMs），表明其在非生物胁迫下对钙离子信号传导的精细调节作用 [39][40]。 在锂离子胁迫的情况下，由于锂离子与钠离子具有相似的物理化学性质 [8]，钙离子信号传导也可能起到关键作用。锂离子通过质膜上的GIPC鞘脂被感知，触发细胞质中的钙离子波动 [22]，其吸收可能通过NSCCs、水通道蛋白和低亲和力阳离子转运蛋白发生 [23][24][25][26][27][28][29][30][31][32][33][34][35][36][37][38][39][40]。褪黑素在锂离子胁迫下调节钾离子平衡是否通过钙离子信号传导实现，以及其下游靶点（如CAX、CBL/CIPK、RBOH）是什么，仍有待研究。本研究通过探讨褪黑素在调节钙离子通量和相关基因网络中的作用，来恢复锂中毒条件下的钾离子平衡。 总体而言，我们假设Mel通过同时调节ROS产生、钙离子信号传导和钾离子转运蛋白活性来缓解小麦对锂的毒性，从而恢复离子平衡。为此，我们采用了一种综合方法，结合离子通量测定、荧光成像、基因表达、药理学和生化分析来揭示Mel介导的锂耐受性的机制基础。

植物材料与生长条件

本研究使用从中国新疆当地供应商购买的春小麦（Triticum aestivum L cv Spring wheat 53）种子。种子先用5%的商业漂白剂表面消毒5-10分钟，然后用双蒸水彻底冲洗5次后进行种植。小麦种子在培养皿中发芽两天后转移到含有半浓度Hoagland营养液的水培系统中。七天大的幼苗接受了10 μM褪黑素（Sigma Aldrich，CAS）的处理。

褪黑素在锂胁迫下改善根系生长

在锂胁迫下，小麦的生长显著减缓，与对照组相比，地上部新鲜重量（SFW）和根部新鲜重量（RFW）分别减少了43%和36%（图1A、B）。此外，锂胁迫还负影响了光合作用（Pn）和气孔导度（gs），分别减少了30%和28%（图1C、D）。 相比之下，褪黑素的施用缓解了锂胁迫的负面影响，恢复了小麦的生长。

褪黑素介导的生长恢复和锂胁迫下的氧化还原平衡

锂毒性通过破坏营养平衡、光合作用和细胞完整性严重影响植物的生长 [8][9][15][27]。在我们的研究中，锂胁迫通过抑制叶片光合作用（图1C、D）减少了小麦的根部和地上部生物量（图1A、B）。这种抑制与地上部锂的积累有关（图1E）。褪黑素预处理显著减少了地上部的锂积累并恢复了生长（图1E）。值得注意的是，根部的锂含量没有受到显著影响。

结论

本研究阐明了褪黑素在缓解小麦锂毒性中的作用，归因于其对钾离子平衡和氧化应激耐受性的协同调节。我们的主要发现表明，褪黑素通过三种相互关联的机制发挥作用：（I）通过降低RBOH基因表达和增强抗氧化活性来控制ROS，从而减少氧化损伤并防止ROS激活的钾离子外排；（II）调节钾离子平衡；（III）通过调节质膜能量代谢。

环境影响

锂（Li）是一种新兴污染物，由于其在锂离子电池和电子废物处理中的使用增加，其土壤浓度在全球范围内上升。锂在土壤中的高迁移性降低了作物生长，对环境造成严重危害，导致食物链污染和生态系统毒性。本研究表明，天然植物激素褪黑素能有效缓解小麦中的锂毒性，通过减少锂的吸收，同时降低锂引起的氧化损伤。

利益声明

作者声明没有利益冲突。

参考文献

[73]; [74]

CRediT作者贡献声明

谢尔盖·沙巴拉（Sergey Shabala）：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、方法学。 邢泽明（Zeming Xing）：撰写 – 审稿与编辑、可视化、软件处理。 雷王（Lei Wang）：软件处理、项目管理、数据分析。 瓦卡斯·乌德·丁·汗（Waqas ud Din Khan）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、实验设计、概念构思。 莫欣·坦维尔（Mohsin Tanveer）：撰写 – 审稿与编辑、软件处理、实验设计、概念构思。