《Journal of Physiology》：Human-derived cardiac-neural microtissues reveal catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia is also a disease of the sympathetic neuron
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本期推荐一篇关于心脏神经调控机制的重要研究。作者利用人诱导多能干细胞（hiPSC）技术，构建了包含心肌细胞（CMs）和交感神经元（SNs）的2D及3D微组织模型，首次系统性地证明儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速（CPVT）不仅是心肌细胞疾病，也累及交感神经系统。研究揭示了CPVT-SNs存在钙瞬变增强、环磷酸腺苷（cAMP）水平升高和超兴奋性等病理特征，并能直接诱发健康心肌细胞的致心律失常活动。这为将CPVT重新定义为神经-心脏疾病、并开发以神经系统为靶点的新型神经调控疗法（neuromodulation therapy）提供了关键证据。
引言
结构性正常心脏的年轻个体发生心源性猝死（SCD）是亟待解决的临床难题，通常由遗传性心律失常综合征（心脏离子通道病）引起。儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速（CPVT）可在肾上腺素能刺激下引发致命性心律失常。尽管临床证据已表明心脏交感神经去神经支配具有挽救生命的疗效，但现有的治疗干预主要仍以心肌细胞（CMs）为靶点。为理解这一治疗悖论，研究团队利用来自健康个体和CPVT患者的人诱导多能干细胞（hiPSC），分化出心肌细胞和交感神经元（SNs），并构建了二维和三维微组织模型来研究神经-心脏相互作用。团队假设CPVT也是一种自主神经系统疾病。
方法
本研究使用了来自健康对照和CPVT患者的多株hiPSC细胞系，通过特定的分化方案分别诱导产生hiPSC来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）和交感神经元（hiPSC-SNs）。通过流式细胞术和免疫荧光染色验证了细胞特异性标志物的高表达率（例如，心肌细胞的肌钙蛋白T（cTnT）和肌球蛋白轻链2v（MLC2v），神经元的酪氨酸羟化酶（TH））。团队还建立了二维单层共培养和三维微滴打印的神经-心脏共培养模型。功能表征手段包括单细胞RNA测序（scRNAseq）、钙成像、膜片钳、荧光共振能量转移（FRET）、微电极阵列（MEA）、光学标测和快速扫描循环伏安法（FSCV）等。
结果
hiPSC分化的心肌细胞和交感神经元表达细胞类型特异性标志物
流式细胞术证实，超过80%的分化心肌细胞同时表达cTnT和MLC2v，80-90%的分化细胞表达TH。单细胞RNA测序分析进一步揭示了细胞异质性，确认了心肌细胞（表达ACTC1、MYL4等）和交感神经元（表达GAL、VIP、NOS1等）的特定集群，并在SNs中检测到TH、RYR2和KCNQ2/3/5等基因的表达。
CPVT交感神经元表现出过度活跃的反应
电生理特性： 膜片钳记录显示，与健康对照相比，CPVT hiPSC-SNs具有显著更高的放电频率和放电次数，并且更多表现为紧张性放电模式。
钙瞬变、cAMP信号和神经递质释放： 钙成像表明，在尼古丁、咖啡因或高钾刺激下，CPVT-SNs的细胞内钙瞬变幅度显著增强。FRET实验显示，CPVT-SNs在尼古丁刺激后产生的环磷酸腺苷（cAMP）水平升高更显著。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和快速扫描循环伏安法（FSCV）测量去甲肾上腺素（NA）释放，发现CPVT神经元有释放更多NA的趋势，尽管差异未达统计学显著性。
CPVT心肌细胞特征
CPVT hiPSC-CMs表现出不规则节律： 微电极阵列记录显示，基线状态下，47%的CPVT hiPSC-CMs表现出心律失常（如心动过速和折返现象），而对照组则无。规则跳动的心肌细胞中，CPVT组的RR间期和场电位时程（FPD）缩短。
不协调的钙释放和增强的cAMP反应： 钙成像显示，CPVT hiPSC-CMs对异丙肾上腺素、高钾或咖啡因刺激表现出增强的钙瞬变，并且在刺激后常出现不规则的自发性钙释放（后除极）。FRET实验证实，CPVT hiPSC-CMs在异丙肾上腺素刺激下cAMP水平的升高显著高于对照组。
M电流调节改变hiPSC交感神经元的电生理兴奋性
单细胞RNA测序发现CPVT神经元中KCNQ2/3表达发生变化。使用M电流（IM）抑制剂XE-991可增加对照神经元的兴奋性并降低其阈值；而使用M电流激活剂瑞替加滨则可降低CPVT神经元的自发放电频率并提高其阈值。计算模型模拟证实，上调M电流电导可以重现实验中观察到的神经元兴奋性降低。
二维共培养中的神经-心脏相互作用
免疫荧光证实了心肌细胞和交感神经元在共培养中的共存。钙成像显示，无论与健康还是CPVT心肌细胞共培养，CPVT神经元的钙瞬变幅度均高于对照组神经元。微电极阵列记录表明，尼古丁刺激能加速神经-心脏共培养中心肌细胞的跳动频率，且与CPVT神经元共培养的健康心肌细胞，其RR间期缩短更为显著。
用于制备功能性3D神经-心脏共培养hiPSC模型的微滴打印技术
研究采用微流控液滴打印技术，成功制备了直径约600 μm的3D心肌和交感神经微组织。这些微组织在培养数天后开始自发收缩，共培养后可见神经元突起向心肌微组织内生长，实现了结构和功能的整合。
光学标测揭示3D CPVT模型中增强的钙瞬变
在3D CPVT微组织中观察到不规则的钙活动： 光学标测显示，健康的CM微组织呈现平滑的激活图和正常波形，而多数CPVT微组织则表现出不规则、振荡样的激活图和多峰波形。CPVT微组织的钙瞬变幅度（CaTA）和钙瞬变衰减至峰值70%的时程（CaTD70）均显著增加。
健康CMs的钙活动受CPVT SNs调节： 在3D共培养体系中，与健康SNs共培养相比，与CPVT-SNs共培养的健康心肌微组织在尼古丁刺激后，表现出心率降低、钙瞬变时程（CaTD70）显著延长，并出现典型CPVT病理特征的多峰钙振荡波形，表明CPVT交感神经元的功能异常足以诱发健康心肌组织的致心律失常活动。
讨论与意义
本研究通过创新的人源心脏-神经微组织模型，首次提供了直接实验证据，表明CPVT的病理表型同样存在于交感神经元中。CPVT-SNs表现出与病变心肌细胞类似的钙处理异常、cAMP信号增强和超兴奋性。更重要的是，病变神经元能直接触发健康心肌细胞的致心律失常活动。单细胞RNA测序揭示了SNs中神经递质通路的失调，并识别出诸如M电流通道等可成药的分子靶点。这些发现解释了为何手术切断交感神经（心脏交感神经去神经支配术）对CPVT患者有效，并将神经系统确立为一个新的治疗靶标。研究进一步提出，CPVT不应仅仅被视为心肌细胞疾病，而应被重新定义为一种神经-心脏疾病，这为开发针对神经系统的神经调控疗法开辟了新途径。
