开发了一种基于TaqMan探针的qPCR检测方法，用于检测引起斑节对虾（Litopenaeus vannamei）幼体后期透明病（TPD）的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）

《Journal of Invertebrate Pathology》：Development and a TaqMan probe-based qPCR assay for Vibrio parahaemolyticus causing translucent post-larvae disease (TPD) detection in Litopenaeus vannamei

Pacific white shrimp养殖面临由高毒力Vibrio parahaemolyticus（携带vhvp-2基因）引起的透明后幼体病（TPD）威胁，本研究开发vhvp-2靶向TaqMan qPCR检测方法，灵敏度达14.64拷贝/反应，特异性100%，抗基质干扰能力强，优于前期SYBR Green法但成本更高，形成互补检测体系。

　　

作者：贾欣、张璐、李欣轩、曾启凡、胡静洁、鲍振民、王梦强

中国广东省南方海洋科学与工程实验室（广州），邮编511458

摘要

太平洋白虾（Litopenaeus vannamei）的水产养殖业面临着由新发现的高毒力Vibrio parahaemolyticus（VpTPD）引起的透明后幼体病（TPD）的严重威胁，这种细菌携带关键的vhvp-2毒力基因。因此，建立一种快速、准确的检测方法对于该疾病的初步诊断和有效管理至关重要。本研究开发了一种基于TaqMan探针的vhvp-2靶向qPCR检测方法，用于快速检测VpTPD。通过严格优化，该方法实现了14.64个拷贝/反应的检测限，具有高扩增效率（E = 109.25%）和强线性相关性（R² = 0.9916），并且与六种主要虾类病原体无交叉反应。该方法在高背景DNA浓度（≤ 2000 ng/μL）下表现出良好的抗干扰能力，对104个样本（100只感染虾和4只健康虾）的临床验证显示100%的诊断灵敏度和特异性，测试结果与实际感染状态完全一致。与之前建立的基于SYBR Green的qPCR方法相比，该方法具有明显优势：基于SYBR Green的方法检测限为10?个拷贝/反应，而基于TaqMan的方法具有更强的抗干扰能力和更短的分析周转时间。值得注意的是，TaqMan探针的合成成本是SYBR Green试剂的10倍。这些实验数据表明，基于TaqMan探针的qPCR方法具有高精度，适用于确认性实验室诊断，而基于SYBR Green的qPCR方法则适用于大规模现场筛查。这种双方法框架为不同水产养殖环境中的TPD预防和检测提供了全面的解决方案。

引言

随着亚洲海鲜消费量的增加，水产养殖在2022年超过了捕捞渔业，成为全球水生动物的主要来源，其中中国贡献了36%的产量（Roy等人，2024年）。这一增长在中国虾产业中尤为明显，到2020年中国已成为全球最大的虾生产国（N’Souvi等人，2024年）。其中，太平洋白虾（Litopenaeus vannamei）由于生长速度快和经济效益高，成为中国海水养殖中发展最快的物种，占中国养殖虾产量的80%–90%（Fu等人，2024年）。然而，各种病毒和细菌病原体在水产养殖中的高流行率和致死性一直限制着L. vannamei养殖的可持续发展（Lee等人，2022年；李和向，2013年）。2019年秋季，中国沿海的大规模L. vannamei养殖场出现了一种新疾病，主要感染孵化后6至12天的后幼体（PL6–PL12）（Harkell，2020a；Harkell，2020b）。受感染的L. vannamei表现出嗜睡、体色变暗以及肝胰腺异常（边缘模糊和变色），随后出现胃肠道空虚，导致90%–100%的急性死亡率（贾等人，2024年；2025年）。由于患病虾体出现玻璃样病变，当地农民将这种疾病称为透明后幼体病（TPD）（Yang等人，2022年）。这种疾病对全国虾苗场造成了巨大的经济损失，使其成为当代虾类养殖中的一个新兴威胁。

研究人员在全国范围内对TPD的病因进行了监测，对五个主要水产养殖省份进行了系统的现场采样和流行病学调查以分离病原体（Zou等人，2020年）。实验室检测排除了由传染性皮下和造血坏死病毒（IHHNV）、黄头病毒（YHV）、白斑综合征病毒（WSSV）、传染性肌坏死病毒（IMNV）、Taura综合征病毒（TSV）以及引起急性肝胰腺坏死病（VpAHPND）的Vibrio parahaemolyticus引起的感染（Yang等人，2022年；Zou等人，2020年）。后续的病原体分离、组织病理学分析和实验挑战证实，TPD主要是由V. parahaemolyticus（VpTPD）引起的，这是一种具有三类毒力基因的细菌病原体（Liu等人，2023年）。基因组筛查发现三个串联毒力基因：Vibrio高毒力蛋白1基因（vhvp-1）、Vibrio高毒力蛋白2基因（vhvp-2）和Vibrio高毒力蛋白3基因（vhvp-3），这些基因位于一个187,791 bp的质粒上（贾等人，2025年）。在挑战实验中，仅携带vhvp-1基因而不携带vhvp-2基因的VpTPD菌株未能在L. vannamei后幼体中产生致死性，而仅携带vhvp-2基因的菌株表现出与VpTPD相当的致死性（Liu等人，2023年）。后续研究表明，单独存在vhvp-1基因或与vhvp-3基因共存都与致病性无关。然而，在毒力菌株中同时检测到vhvp-2和vhvp-3基因后，推测vhvp-3基因可能在vhvp-2基因介导的高毒力表型中起辅助作用（贾等人，2025年）。虽然vhvp-3基因的精确致病机制需要进一步研究，但vhvp-2基因编码的Vibrio高毒力蛋白2（VHVP-2）被确定为VpTPD致病性的主要毒力因子（Liu等人，2023年；张等人，2024年；贾等人，2025年）。

关于Vibrio菌株中vhvp-2基因的传播机制及其在致病菌株进化中的作用，目前仍不完全清楚，需要进一步研究（贾等人，2023年）。为了防止VpTPD的进一步传播，L. vannamei养殖业迫切需要快速有效的控制措施。与耗时的酶联免疫吸附测定（ELISA）和相对昂贵的基因测序相比，核酸扩增技术具有反应时间短、操作简单和适用范围广等优点（Gong等人，2021年）。在这些扩增方法中，实时定量聚合酶链反应（qPCR）在检测速度、灵敏度和结果可靠性方面优于传统PCR，使其成为相关应用中最广泛采用的技术之一（Gasparic等人，2010年）。在之前的工作中，我们开发了三种基于SYBR Green的qPCR检测方法，能够特异性检测位于187,791 bp质粒上的vhvp-1、vhvp-2和vhvp-3基因（贾等人，2026年）。对这些方法的比较评估显示，针对vhvp-2基因的检测方法具有更高的灵敏度和稳定性（贾等人，2026年）。然而，基于SYBR Green的qPCR方法基于染料与双链DNA（dsDNA）的相互作用，容易产生引物二聚体和非特异性扩增产物，因此需要熔解曲线分析来验证扩增特异性（Cruz-Flores等人，2019年；张等人，2023年）。相比之下，基于TaqMan探针的qPCR方法通过捕获延伸阶段探针水解释放的荧光信号实现精确检测，有效避免了非特异性干扰（Tajadini等人，2014年）。鉴于基于TaqMan探针的qPCR的优越性和vhvp-2基因作为检测目标的重要性，本研究的主要目标是开发相应的TaqMan检测方法，并将其性能与已建立的SYBR Green方法进行比较。这项工作为VpTPD的快速检测和早期干预提供了更稳健的方法学基础。

在本研究中，我们建立了一种基于TaqMan探针的qPCR检测方法，针对vhvp-2基因，以实现VpTPD的快速检测。通过检测优化以及灵敏度、特异性和稳健性的评估，该方法证明了其在实验室环境中实时检测临床样本的能力。此外，该方法为水产养殖设施的高通量筛查和预防应用提供了实用工具。

部分内容片段

虾样本和病原体准备

用于试验的虾样本是在我们的实验条件下实验室培育的。使用TIANamp Marine Animals DNA Kit（DP 324，TianGen，中国）从肝胰腺中提取总DNA。VpTPD、WSSV、IHHNV、甲壳类动物信使坏死病毒（CMNV）、TSV和Ecytonucleospora hepatopenaei（EHP）由我们的实验室提供并维持。虾样本和病原体悬浮液均储存在-80 ℃。

重组质粒构建

选择vhvp-2基因的ORF1b片段作为目标

引物筛选

使用常规PCR扩增了七对引物，根据琼脂糖凝胶电泳结果（图1），初步选择了四对没有非特异性扩增且扩增效率高的引物（TPD-F1 / TPD-R1、TPD-F2 / TPD-R2、TPD-F4 / TPD-R4和TPD-F7 / TPD-R7）。随后，这四对引物通过基于TaqMan探针的qPCR检测进行了进一步筛选，选择Ct值最低且荧光信号最强的引物对。

讨论

L. vannamei是全球水产养殖中最重要的海鲜物种之一（李等人，2018年；田等人，2024年）。由于其巨大的经济价值和市场需求，其养殖规模在中国和东南亚国家显著扩大（李和向，2013年）。然而，由弧菌病爆发引起的严重经济损失一直阻碍着这些地区的产业发展（Roy等人，2020年）。TPD是一种由VpTPD引起的新型细菌性疾病

CRediT作者贡献声明

贾欣：撰写 – 原始草稿，研究。 张璐：方法学，研究，资金获取。 李欣轩：研究。 曾启凡：资金获取。 胡静洁：项目管理。 鲍振民：监督，资金获取。 王梦强：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了河北省创新能力提升项目（253A6701D）、海南省科技创新人才项目（KJRC2025B14）以及三亚亚洲湾科技城博士研究创新基金联合项目（HSPHDSRF-2024-02-007）的支持。