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平褶双壳纲（Ostrea denselamellosa）血液中分离并培养了两种Ichthyosporea（Mesomycetozoea）新物种Ich1和Ich2，通过分子系统学鉴定为Dermocystida属，比较了其孢子发育特征和环境适应性，为海水养殖病害防控提供新依据。
Jinxia Long|Yu Chen|Seung-Hyeon Kim|S.D.N.K. Bathige|H.M.V. Udayantha|W.A.A.H. Kalhari|Hye-Mi Lee|Kyung-Il Park
韩国群山国立大学海洋与生物科学学院水生生物医学系，558 Daehakro，群山 54150
摘要
中菌虫纲（Ichthyosporea）是一类早期分化的、类似真菌的原生生物，位于动物与真菌的分化分支附近，但其生命周期和宿主关系仍知之甚少。在本研究中，我们从韩国西海岸采集的野生扁平牡蛎（Ostrea denselamellosa）的血淋巴中分离并培养出了两个中菌虫纲菌株（Ich1和Ich2）。通过小亚基（18S）rDNA测序，确定这两个菌株属于Dermocystida类群。BLAST分析显示Ich1与先前报道的Ichthyosporea序列具有非常高的相似性（约98.70–99.80%），而Ich2的相似性稍低（约98.50–98.70%）。最大似然法和贝叶斯推断系统发育分析表明，Ich1和Ich2属于Dermocystid类群中的密切相关的但不同的谱系。体外观察记录了它们的孢子囊发育和内孢子释放过程，其中Ich1快速发育并释放相对较大的内孢子（约2.60–4.00微米），随后释放较小的内孢子（<1.10微米）；而Ich2最初产生球形孢子囊，释放约5微米的内孢子，后来形成大量颗粒状孢子囊，释放较小的可移动内孢子（<2.70微米）。DAPI染色证实了这两种菌株之间核结构的差异。Ray氏流体硫代甘油酸盐培养基（RFTM）测试明确区分了这些牡蛎菌株与Perkinsus olseni，因为前者缺乏休眠孢子的形成，并且细胞壁对碱敏感，从而确认它们不属于Perkinsus属。生长实验表明，这两种菌株在15–30°C和15–45 psu的条件下具有广泛的耐受性，最适生长条件分别为25–30°C和25–35 psu；Ich1的细胞密度始终高于Ich2。据我们所知，这是首次从牡蛎中分离并培养出两种Ichthyosporea菌株的报道。这些发现扩展了已知的中菌虫纲在双壳类动物中的多样性和宿主范围，建立了发育和诊断的基准，并为未来水产养殖系统的监测提供了重要信息。
引言
扁平牡蛎（Ostrea denselamellosa）是一种具有经济和生态价值的双壳类物种，自然分布于中国、日本和韩国沿岸的潮间带（Xu和Zhang，2008）。作为一种滤食性生物，它通过循环营养物质、改善水质以及为其他底栖物种提供栖息地来增强沿海生态系统的健康。然而，由于过度捕捞、栖息地破坏、环境变化和疾病爆发，近年来其自然种群数量急剧下降（Chen等人，2011）。与其他在东亚广泛养殖的牡蛎物种不同，O. denselamellosa缺乏专门的养殖或恢复计划，因此对环境压力和病原体仍然非常敏感。尽管以往的研究主要集中在它的生殖生物学、遗传学和水产养殖潜力上，但关于其健康状况和相关微生物多样性的研究仍然很少（Dong等人，2023；Insua和Thiriot-Quievreux，1991；Yu等人，2016），这导致了对影响种群下降因素的理解存在关键空白。
寄生虫感染是全球水产养殖面临的持续挑战，在气候变化和环境压力的双重影响下，人们对它们的分布、多样性和致病性的担忧日益加剧（Cable等人，2017；Cho等人，2022）。中菌虫纲（Mesomycetozoea），也称为鱼孢子虫（Ichthyosporeans），历史上被认为与鱼类和甲壳类动物有关，最初被归类在DRIP分支中，包括Dermocystidium、Rosette agent、Ichthyophonus和Psorospermium，这些属代表了与真菌和动物密切相关的早期分化谱系（Ragan等人，1996）。后来引入了Ichthyosporea这一分类名称，以反映它们在鱼类中的频繁出现（Cavalier-Smith，1998），而更广泛的术语Mesomycetozoea则涵盖了感染无脊椎动物、鸟类和哺乳动物的其他物种（Herr等人，1999）。系统发育学上，中菌虫纲属于后鞭毛生物（Opisthokonta）中的单细胞真核生物，位于动物和真菌的分化分支附近（Adl等人，2019；Mendoza等人，2002；Paps等人，2013）。目前它们被分为两个得到广泛支持的目：Ichthyophonida和Dermocystida，这两者的主要区别在于其变形虫期和鞭毛期的形态特征（Marshall和Berbee，2011；Mendoza等人，2002）。尽管它们作为新兴病原体的认识日益增加，但大多数成员仍缺乏详细的描述，其生命周期、传播策略和生态作用仍然很大程度上未被探索。
在中菌虫纲中，Dermocystida目包括几个寄生虫属，尤其是Dermocystidium、Amphibiocystidium和Rhinosporidium，它们感染多种淡水和海洋宿主（Mendoza等人，2002；Gozlan和Combe，2023）。这些寄生虫已在多个地理区域被报道，并因导致水产养殖物种的高死亡率而造成重大经济损失（Hassan等人，2014；Kirkbright等人，2016；Sirri等人，2020）。过去几十年的研究报告显示，它们的宿主范围非常广泛，已从Anguilla rostrata、Oncorhynchus tschawytscha和Perca fluviatilis等鱼类，以及Rana esculenta和Rana italica等两栖动物中分离出相关物种（Fagotti等人，2020；Liu等人，2021；Pereira等人，2005；Ragan等人，1996）。许多鱼孢子虫既作为寄生虫也作为共生生物存在于海洋和淡水宿主体内，但也有自由生活的种类（Marshall等人，2013；Grau-Bové等人，2017）。Bathige等人（2024）首次鉴定出了寄生性的鱼孢子虫，强调了它们的生态多样性和对软体动物宿主健康的潜在影响。迄今为止，它们在扁平牡蛎O. denselamellosa中的存在及其潜在影响尚未被研究。鉴于该物种的生态重要性和脆弱性，建立关于其宿主相关微生物群落和环境因素的基线数据对于理解种群下降情况以及制定未来的水产养殖和恢复策略至关重要。本研究旨在调查从韩国西海岸采集的两种扁平牡蛎（O. denselamellosa）菌株的生命周期、系统发育关系和环境需求。通过显微镜和分子分析，我们描述了它们的发育阶段，并明确了它们在中菌虫纲中的进化位置。此外，我们还研究了温度和盐度对菌株生长的影响，以确定有利于其繁殖的环境条件。尽管这两个菌株都是从牡蛎血淋巴中分离出来的，但它们的生态作用仍不清楚。它们出现在血淋巴中表明可能存在共生或病原关系，这需要进一步研究。
样本采集与处理
2023年9月，我们在韩国西海岸的Gaeya岛潮间带采集了野生扁平牡蛎O. denselamellosa（平均壳长：92.76±16.26毫米，N=23个）。样本被放入装有冰块的冷藏箱中（保持约4°C），并在6小时内运输到韩国群山国立大学水生生物医学系的海洋寄生虫学实验室。到达后，进行了包括壳长、壳宽等生物测量。
Ichthyosporea菌株的分子特征
使用通用真核生物引物通过常规PCR成功扩增出两个原生生物菌株Ich1和Ich2。扩增产物中，Ich1的序列长度为1383 bp，Ich2的序列长度为1387 bp。NCBI BLASTn分析显示，Ich1与
Ichthyosporea物种NK52的18S rRNA基因（GenBank登录号
KM213082）具有99.86%的序列相似性。相比之下，Ich2与未培养的真核生物克隆KRL01E30的18S rRNA基因（GenBank登录号
讨论
本研究通过从牡蛎血淋巴中分离、培养并描述两个中菌虫纲菌株，填补了我们对与野生Ostrea denselamellosa相关的中菌虫纲多样性的理解空白。18S rDNA序列分析表明，这两个菌株都属于Dermocystida类群，其中Ich1与先前报道的海洋来源的Ichthyosporea序列具有非常高的相似性，而Ich2的相似性略低，表明它们属于相关但不同的谱系。
CRediT作者贡献声明
Jinxia Long：撰写——初稿、方法学、调查、概念化。Yu Chen：方法学。Seung-Hyeon Kim：资源、方法学。S.D.N.K. Bathige：撰写——审稿与编辑。H.M.V. Udayantha：方法学。W.A.A.H. Kalhari：方法学。Hye-Mi Lee：撰写——审稿与编辑。Kyung-Il Park：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。
资助
本研究得到了韩国海洋科学技术促进院（KIMST）的支持，资金来源于韩国海洋渔业部[项目编号RS-2022-KS221679]和韩国国家研究基金会[项目编号NRF-2022R1A2C1009209]。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
