一种可靠且准确的基于kDNA的内部qPCR检测方法，用于在显微镜检查阴性的皮肤利什曼病中检测利什曼虫DNA

《Acta Parasitologica》：A Reliable and Accurate In-House kDNA-Based qPCR Assay for Detection of Leishmania DNA in Microscopy-Negative Cutaneous Leishmaniasis

皮肤利什曼病快速诊断技术研究中，通过qPCR检测89份疑似阴性样本发现9例阳性（10.58%），敏感性高于显微镜（4.49%），最低检出限0.001 ng/μl，与ITS-PCR和测序结果一致。

摘要

引言与目的

皮肤利什曼病（CL）是一种发生在热带和亚热带地区的地方性疾病，由利什曼原虫（Leishmania）引起。该疾病的快速准确诊断对于预后、控制和预防至关重要。鉴于准确诊断的重要性以及避免常用方法可能出现的错误，我们旨在设计一种使用定量实时PCR（qPCR）的有效方法，以实现对该疾病的准确且可行的诊断。

材料与方法

共纳入109个样本：89个来自Semnan和Golestan省流行地区的临床疑似CL患者的阴性涂片，10个寄生虫载量不同的阳性样本，以及10个患有其他类似CL症状的皮肤疾病的患者的样本，以评估检测的特异性。DNA采用酚-氯仿法提取。内部开发的qPCR使用针对利什曼原虫动质体DNA的特异性引物进行。此外，还使用了传统的ITS-PCR作为补充方法。PCR阳性样本被送交Sanger测序，结果与患者的临床数据进行了比对。

结果

在重新检查阴性涂片后，通过显微镜方法发现有4例（4.49%）为阳性。在85个阴性样本中，qPCR检测出9例阳性（10.58%）。该技术证明了其在临床条件下能够检测到极低水平的寄生虫载量（1+级）。实验室条件下的检测限确定为0.001 ng/μl。传统的ITS-PCR在qPCR阳性样本中识别出6例阳性。测序分析确认所有分离株均属于Leishmania major。

讨论与结论

本研究结果表明，内部开发的qPCR是一种高度敏感和特异的CL诊断工具，即使在阴性涂片的情况下也能发挥作用。它可以作为显微镜检查的宝贵补充和可靠方法，从而实现更早、更准确的诊断，并防止误诊或不当治疗。此外，在所有阳性病例中鉴定出L. major，进一步支持了研究区域现有的流行病学数据。