《Autism Research》：Mixed Evidence for Impact of Early Infant Gut Microbiome and Later Development of Autism Spectrum Disorder in the MARBLES Prospective Cohort Study
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本综述前瞻性地探究了婴儿期（0-7个月）肠道微生物组组成与后期（36个月时）神经发育结局（包括ASD、非典型发育（non-TD）和典型发育（TD））之间的关系。研究发现，在控制了混杂因素并经过多重比较校正后，未发现与ASD或non-TD相关的显著差异（如α多样性、β多样性或特定细菌类群）。但在校正前，观察到ASD组婴儿早期Veillonella和Flavonifractor属水平略低。研究表明，与分娩方式和喂养方式等早期因素相比，ASD相关的微生物组差异在婴儿早期可能更为细微。研究强调了未来需要更大规模、覆盖更晚期时间点的纵向研究来揭示与ASD相关的肠道微生物组动态轨迹。
引言
孤独症谱系障碍（ASD）是一种神经发育障碍，常伴有免疫失调、代谢异常和胃肠道（GI）症状。肠道微生物组（Gut Microbiome）因其与许多神经系统疾病的关联，成为ASD研究的关键领域。已有研究表明，年龄较大的ASD儿童肠道菌群与典型发育（TD）儿童存在差异，但大多数研究为横断面设计，聚焦于已确诊的儿童。因此，早期婴儿肠道微生物组的变化是否先于ASD行为表现出现，仍是未知领域。本研究旨在探索生命最初几个月（0-7个月）的肠道微生物组是否与后期的ASD诊断相关。
方法
本研究基于MARBLES（婴儿孤独症风险标志物-早期迹象学习）前瞻性队列，该队列招募已有ASD患儿的母亲，其后续婴儿罹患ASD的风险较高（约20%）。研究收集了婴儿0-7月龄间的粪便样本，并在儿童36月龄左右使用自闭症诊断观察量表（ADOS）和穆林早期学习量表（MSEL）等金标准工具进行临床评估，将儿童分为ASD、非典型发育（non-TD）和典型发育（TD）三组。共分析了137名参与者（ASD 42例，non-TD 16例，TD 79例）的465份粪便样本。微生物组分析采用16S rRNA基因（16S rRNA gene）测序技术，使用QIIME2流程和DADA2算法处理数据。统计分析包括评估α多样性（Shannon指数和观察到的扩增子序列变异（ASVs））、β多样性（稳健Aitchison距离和PERMANOVA分析）以及使用ANCOM-BC2进行的差异丰度分析，所有模型均根据有向无环图（DAG）调整了分娩方式、前6个月喂养方式、父母房屋所有权和儿童年龄等协变量。
结果
1. 受试者特征
137名参与者中，57%为男性，64%为阴道分娩，36%为剖腹产。所有婴儿在观察期内均摄入过母乳，其中42%为纯母乳喂养，58%为混合喂养。
2. α多样性与β多样性分析
调整潜在混杂因素后，后期发展为ASD或non-TD的婴儿，其α多样性（Shannon指数和观察到的ASVs）与TD婴儿相比无显著差异。不过，研究发现混合喂养婴儿的Shannon多样性（p= 0.002）和微生物丰富度（p= 0.001）显著高于纯母乳喂养婴儿。此外，α多样性随年龄增长而增加（Shannon指数p= 0.007；观察到的ASVs p= 0.000）。
在β多样性方面，基于稳健Aitchison距离和PERMANOVA分析，在任何三个分层时间点（0-1个月、2-3个月、4-7个月），ASD、non-TD与TD参与者的微生物群落组成均无显著差异。然而，在0-1月龄和4-7月龄时，混合喂养与纯母乳喂养的婴儿之间、阴道分娩与剖腹产婴儿之间的微生物群落存在显著差异。
3. 差异丰度分析
经过多重比较校正后，未发现任何ASV、科或属水平的细菌类群在ASD/non-TD组与TD组之间存在显著差异。然而，分析揭示了显著的年龄相关变化：随着年龄增长，Fusicatenibacter、[Ruminococcus]_gnavus_group（R. gnavus）、Blautia、Erysipelatoclostridium和Bifidobacterium等属的相对丰度增加，而Staphylococcus、Streptococcus和Escherichia-Shigella等属的相对丰度下降。
值得注意的是，在未校正多重比较前，数据显示后期发展为ASD的婴儿，其Veillonella和Flavonifractor属的水平略低于TD婴儿。同样，后期发展为non-TD的婴儿，其Enterococcus和R. gnavus的相对丰度似乎略高于TD婴儿，但这些差异在校正后不具统计学意义。x-axis is labeled by later neurodevelopmental outcomes.">
讨论
本研究未在0-7月龄婴儿中发现与ASD或non-TD相关的肠道微生物组组成（α多样性、β多样性、特定类群）的显著差异。这可能意味着：1) 与ASD相关的微生物组变化可能发生在7个月龄之后；2) 这种变化可能比分娩方式、喂养方式等早期因素更为细微；3) 研究样本量可能不足以检测到微小的效应量。
尽管主要结果为阴性，但未校正的差异趋势与既往针对年长ASD儿童的部分研究结果存在一致性。例如，Veillonella和Flavonifractor的减少在ASD研究中均有报道。这些细菌与短链脂肪酸（SCFA）的产生有关，而SCFA对肠道屏障功能和免疫调节至关重要。研究同时观察到婴儿期肠道菌群随年龄发生的显著转变，从兼性厌氧菌（如Staphylococcus）向专性厌氧菌（如Blautia、Bifidobacterium）过渡，这反映了肠道环境的成熟。
研究局限与未来方向
本研究的局限性包括：未调查7个月龄后的时间点；研究对象均为ASD高风险家庭后代，可能限制结论的普适性；使用的16S rRNA测序无法提供物种或菌株水平的精确信息；COVID-19大流行期间，部分儿童使用了替代性诊断工具。未来研究应扩大样本量，纳入8-12月龄等更晚期的婴儿，并采用宏基因组测序以获得更高的分类学分辨率和功能信息，以更深入地理解肠道微生物组与ASD发展之间的纵向关联及其潜在机制。
