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北极蓼花中13种酚类化合物通过单晶X射线衍射和微晶电子衍射技术实现微量（微克级）结构解析，解决了传统方法需要毫克级样本及破坏性水解的问题，同时证实该方法对糖苷异构体和结合位点的精准识别能力，为稀有植物化学研究提供环保高效的新手段。
平野秀吾（Hyuga Hirano）|菊地隆（Takashi Kikuchi）|坂木原芙田（Futa Sakakibara）|村井良典（Yoshinori Murai）
东京农工大学联合研究生院农业科学系，日本东京府府中市西和町3-5-8
摘要
对于体积较小的样品，糖苷的结构测定通常被认为较为困难，因为结构异构体的存在以及修饰结构多样的结合位点通常需要较大的样品量才能通过核磁共振（NMR）进行分析。在这项研究中，我们旨在利用单晶结构分析技术建立一种基于小样品量的结构测定方法。我们从高山植物Diapensia lapponica subsp. obovata的花朵中分离出了13种酚类化合物（1-13），其中6种化合物的结构通过单晶X射线结构分析确定，另外2种通过微晶电子衍射结构分析确定。我们成功地在几微克的样品量下，无需使用水解等传统耗样方法（这些方法难以识别结构异构体和糖的结合位点），就确定了糖苷的相对排列方式，包括糖的类型和结合位置。对于仅通过质谱（MS）或核磁共振（NMR）难以确定的成分（如单宁），也通过精细单晶分析得到了其结构。这些结果证明了这种新分析方法的有效性，它能够在最小化对自然环境负担的同时实现对微量样品的高精度结构分析。
引言
糖苷是天然产物中最常检测到的化合物类别之一，占《天然产物词典》[1]中收录化合物的16.19%。然而，由于存在大量的结构异构体以及能够形成糖苷键的多个羟基，仅依靠质谱无法确定糖苷的结构。核磁共振（NMR）光谱已被广泛用作糖苷结构鉴定的有效方法[2]，但它需要几毫克的样品量进行纯化[3]。在天然产物化学研究中，尤其是在处理稀有植物时，需要采用能够减少大规模采集对环境影响的方法。此外，糖苷的化学位移集中在较窄的范围内，这使得糖苷键的测定变得费时且高度依赖专业技能[4]。
为了解决这些挑战，我们专注于单晶衍射技术，该技术可以从几微克的样品中确定分子结构，并且近年来受到了越来越多的关注[5]。由于最近的技术创新，单晶X射线衍射仪的性能有了显著提升。高灵敏度和低噪声的混合光子计数（HPC）探测器已经取代了2000年代之前的电荷耦合器件（CCD）探测器和成像板（IP）探测器。这一进步使得原本需要一整天的测量现在可以在几分钟到几小时内完成。此外，自动化数据处理和结构分析软件的进步，以及能够快速识别分子结构的“这是什么？”软件的实际应用，使得整个过程（包括结构分析）在小时内完成变得普遍[6]。然而，即便采用了这些方法，仍有一类化合物的结构难以直接确定，酚类糖苷就是其中的一个例子。
酚类糖苷是一类由植物广泛产生的次级代谢物，长期以来一直被视为药用资源[7]。这些化合物大多以极性较高的糖苷形式存在，糖基的存在与否会影响其生物利用度，因此糖基化是一种重要的结构修饰[8,9]。然而，由于其结构多样性，已经报道了许多结构异构体[10]。此外，酚类糖苷在分离后通常呈无定形粉末状态[11]，因此形成单晶可能较为困难。因此，关于通过单晶X射线衍射确定其结构的报道仍然有限[[12], [13], [14]]。
在研究高山植物时，最小化样品量尤为重要，因为这些植物的体积小且难以获取，这给天然产物化学的研究带来了显著障碍。为了测试我们的小样品量实验方法，我们选择了Diapensia lapponica subsp. obovata（报春花科），这种高山植物分布于北半球，在日本从北海道到本州中部的高山地区都有分布[15]。先前的研究已经报道了该物种叶片中存在黄酮类化合物，但花朵尚未被研究[16]。已知植物会在花朵中积累酚类化合物，用于紫外线防护和吸引传粉者等目的，而且这些化合物在叶片和花朵中的组成往往不同[17,18]。然而，由于D. lapponica的花朵小而薄，且开花期仅持续几周，因此大规模采集植物材料较为困难。
在这项研究中，我们旨在开发一种通用、简单且快速的微尺度糖苷结构鉴定方法，并评估其在样品采集受限植物中的应用可行性。
材料与方法
本研究中的化合物表征方法包括样品采集与提取、分离与纯化、分子量测定，以及随后通过单晶X射线结构分析或电子衍射结构分析进行结构鉴定，具体流程如图1所示。
结果
本研究共分离出了13种酚类化合物，其中6种通过单晶X射线结构分析（SCX）确定了结构，2种通过微晶电子衍射（MicroED）确定结构，另外3种通过与标准化合物比对确定结构（见图2和表1）。化合物9-13的结构见补充数据2。每种化合物的CIF文件和CheckCIF报告见补充数据3。晶体分析信息详见表2。值得注意的是，对于化合物2和4，我们成功获得了适合分析的单晶。
酚类糖苷的结构鉴定
通过单晶衍射成功鉴定的酚类糖苷（2–8）的特点在于，传统上鉴定其糖异构体和糖苷键位置需要使用耗样较多的技术，如添加试剂的紫外光谱位移观察或酸水解[24]。相比之下，本研究表明，即使是从几微米到亚微米厚的微晶中，也能确定糖的类型和结构。
结论
在这项研究中，我们利用单晶X射线结构分析和微晶电子衍射结构分析，成功地在几微克的样品量下确定了酚类糖苷的相对构型，克服了传统方法通常需要大量样品和复杂程序的挑战。该技术的应用以D. lapponica为例进行了验证，这是一种典型的高山植物。
作者贡献声明
平野秀吾（Hyuga Hirano）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法论设计、实验设计、数据管理、概念构思。菊地隆（Takashi Kikuchi）：撰写——审稿与编辑、数据可视化、软件应用、方法论设计、实验设计、数据分析。坂木原芙田（Futa Sakakibara）：项目监督、项目管理、方法论设计、概念构思。村井良典（Yoshinori Murai）：撰写——审稿与编辑、项目监督、资源协调。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
平野秀吾表示获得了日本学术振兴会的财务支持。村井良典表示获得了日本学术振兴会的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益冲突。致谢
我们感谢东北大学植物园的伊藤隆博士（Takuro Ito）对植物采集工作的支持。本文的英文编辑工作得到了东京大学研究生院Anna K. Valchanova的帮助。本研究得到了日本学术振兴会的Sasakawa科学研究资助（2023-5029）、JSPS研究员资助（24KJ1011）、JSPS科研费资助（Y.M.，23K05503）以及国立博物馆极端环境综合研究项目的支持。
