《Immunity, Inflammation and Disease》：An In Silico Omics Investigation of the Lactobacillus Genus Complex for Allergenicity Mitigation
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本文通过计算机组学方法，对161个乳酸杆菌属参考菌株的基因组和蛋白质组进行了系统性分析，旨在筛选具有缓解过敏性疾病潜力的益生菌候选株。研究重点评估了核苷酸免疫抑制基序（NISM）的丰度、细胞色素P450（CYP450）酶的存在以及潜在致敏性蛋白表位。结果表明，清酒乳杆菌（Latilactobacillus sakei）在NISM密度、CYP450酶存在且无稳定致敏表位方面表现突出，是潜在的抗过敏益生菌优选菌株。本研究为功能性益生菌的开发提供了重要的生物信息学筛选依据。
1 引言
在调节免疫反应的诸多方法中，益生菌是重要的一员。微生物群的微妙平衡对维持免疫稳态至关重要，而这种平衡受生活方式和饮食习惯的影响。失衡可能导致食物过敏等疾病的发展。乳酸杆菌等益生菌可以通过多种机制调节免疫，包括产生抗菌代谢物、竞争抑制病原菌、增强上皮屏障功能等。特别是，益生菌中的某些特定成分，如核苷酸免疫抑制基序（NISM）或某些代谢物（如17,18-环氧二十碳四烯酸，17,18-EpETE），显示出降低过敏反应发生率的潜力。然而，一些细菌蛋白本身也可能具有致敏性或引发交叉反应。因此，本研究旨在通过计算机组学分析方法，对乳酸杆菌属复合体的基因组和蛋白质组进行全面分析，以识别具有缓解过敏潜力且安全的菌株。
2 材料与方法
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2.1 数据收集
研究分析了来自乳酸杆菌属复合体的161个参考基因组和蛋白质组，数据来源于UniProt和NCBI等公共数据库。分析涵盖了乳酸杆菌（Lactobacillus）、乳酸乳杆菌（Lacticaseibacillus）、粘液乳杆菌（Limosilactobacillus）、清酒乳杆菌（Latilactobacillus）等多个相关属的物种。
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2.2 核苷酸免疫抑制基序的鉴定
采用系统方法鉴定了乳酸杆菌基因组中NISM的存在。通过计算每百万碱基对的基序密度（Motif Per Million, MPM），并将其与潜在的免疫调节效应相关联。使用EMBOSS和MAST等生物信息学工具，分析了包括TCAAGCTTGA、TTAGGG等在内的17个已知NISM在161个基因组中的分布。
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2.3 蛋白质分析与致敏性预测
为评估乳酸杆菌基因组编码蛋白的潜在致敏性，使用了AlgPred2.0、IEDB和AllergenOnline等预测工具。这些工具基于序列特征、IgE表位比对等方法，评估蛋白质的致敏潜力和交叉反应性，以识别致敏性表位。
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2.4 消化酶影响评估
使用PeptideCutter工具模拟胃肠道消化酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）的切割作用，评估预测出的致敏性表位在消化过程中的稳定性。那些在消化后仍能保持完整的“稳定致敏性表位”被认为是潜在的风险因素。
3 结果
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3.1 排名前十的核苷酸免疫抑制基序
在分析的乳酸杆菌物种中，NISM的MPM值排名前十的物种包括：清酒乳杆菌（Latilactobacillus sakei）、瘤胃乳杆菌（Lactobacillus ruminis）、粘液粘液乳杆菌（Limosilactobacillus mucosae）、植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）等。其中，清酒乳杆菌的NISM密度较高。
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3.2 菌株筛选与数据获取
初步筛选后，最终确定了161个具有高质量参考蛋白质组的乳酸杆菌物种和菌株用于分析。
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3.3 致敏原和稳定表位的鉴定
利用AlgPred2.0、IEDB和AllergenOnline预测了所选乳酸杆菌物种的致敏性表位，并使用PeptideCutter预测了稳定致敏性表位。在总计53,438个蛋白中，共鉴定出557个致敏性表位，其中仅有17个在模拟消化后保持稳定。具体而言，在NISM排名前十的物种中，植物乳杆菌、副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）等含有的致敏性表位数量较多，而嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的数量最少（10个）。在稳定表位方面，副干酪乳杆菌、短乳杆菌和罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）分别有2、2和1个稳定表位，而清酒乳杆菌则未发现任何稳定致敏性表位。
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3.4 细胞色素P450的检测
研究发现，在分析的乳酸杆菌属复合体中，仅在清酒乳杆菌和Secundilactobacillus acidipiscis的基因组中检测到了细胞色素P450（CYP450）基因的存在，其他物种中则未发现。
4 讨论
过敏可由多种来源引发，食物过敏尤其与Th2型免疫反应失衡有关。益生菌中的NISM可能有助于纠正这种失衡。本研究筛选出的高NISM密度菌株具有此潜力。此外，ω-3多不饱和脂肪酸（PUFA）具有免疫抑制和抗炎作用。其中，代谢产物17,18-EpETE被证实可抑制食物过敏发展。CYP450酶是催化EPA生成17,18-EpETE的关键酶。因此，在清酒乳杆菌中发现CYP450基因，意味着其可能具备产生这种抗过敏脂质介质的能力。
既往研究支持了清酒乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌等不同菌株的免疫调节潜力，但效果具有菌株特异性。本研究通过计算机分析，不仅突出了乳酸杆菌属内免疫调节潜能的多样性，还提供了一个筛选安全有效菌株的基础框架。清酒乳杆菌因其高NISM密度、存在CYP450基因且无稳定致敏性表位，成为特别有前景的候选菌株。
同时，研究也指出了计算机分析的局限性。致敏性预测主要针对IgE介导的机制，未能涵盖T细胞介导的反应。菌株的免疫调节潜力是其产生的各种代谢物（如短链脂肪酸、免疫调节肽）综合平衡的结果，且受肠道环境压力（如低pH、消化酶）的影响，可能诱导“兼职蛋白”表达，从而改变表位的可及性。此外，CYP450基因的存在仅代表潜力，其功能表达和代谢产物的生成需要进一步实验验证。
5 结论
综上所述，本计算机筛选研究将清酒乳杆菌确定为乳酸杆菌属复合体中一个极具潜力的候选菌株，用于进一步的深入研究。其基因组特征（高NISM密度、存在CYP450基因、无稳定致敏性表位）表明其IgE介导的致敏风险较低，并可能通过产生抗炎代谢物来缓解过敏。早期临床研究也支持摄入清酒乳杆菌对改善特应性湿疹-皮炎综合征患儿的临床症状有积极作用。
然而，必须强调的是，这一潜力需要通过功能实验来验证，以评估其在生理相关条件下的整体免疫调节输出平衡。因此，虽然本研究提出了清酒乳杆菌作为未来研究的一个非常有希望的候选者，但仍需更多的实验研究来全面了解其治疗过敏性疾病潜力和安全性。未来的研究方向应包括：寻找生物标志物、对17,18-EpETE等代谢物进行机制研究、扩展比较基因组分析、交叉反应性研究以及临床试验。
