《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Investigating the Relationships Among Gut Microbiota, Inflammatory Cytokines, Cerebrovascular Diseases, and the Mediation Pathways
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这篇综述通过孟德尔随机化(MR)和中介分析方法，深入探究了肠道菌群(GM)与脑血管疾病(CeVD)之间的因果关联，并首次阐明了炎症因子在这一通路中的关键介导作用。研究发现了33种与CeVD显著相关的肠道菌群物种和18种相关的炎症细胞因子，并识别出10条由炎症因子介导的“肠道菌群-CeVD”因果通路。这项工作为从肠道微生物-免疫轴角度理解CeVD的病理机制和开发新的防治策略提供了重要的遗传学证据和潜在靶点。
引言
脑血管疾病(CeVD)是由脑血管异常导致脑组织血流中断和损伤的一系列疾病，主要包括缺血性卒中(IS)、脑出血(ICH)和蛛网膜下腔出血(SAH)，占全球卒中病例的87%。CeVD是全球第二大死亡原因，随着全球人口老龄化，其发病率不断上升，对公共卫生构成日益严重的威胁。尽管疾病负担沉重，其确切机制以及有效的预防和治疗策略仍不甚明了。
肠道菌群是一个代谢活跃、分类多样的生态系统，定植于人类胃肠道。研究表明，大脑与肠道菌群之间存在通过微生物-肠-脑轴实现的双向联系。肠道菌群及其代谢物通过调节氧化应激、细胞凋亡、神经炎症等关键过程影响IS的发生发展。动物研究还表明，肠道菌群可通过调节中性粒细胞浸润影响SAH后的早期脑损伤。另一方面，炎症细胞因子是由免疫细胞产生的信号分子，在调节炎症和免疫反应中起关键作用，与CeVD的发生和恶化密切相关。
然而，人体内复杂的相互作用使得在涉及肠道菌群、炎症和CeVD的研究中难以测量混杂因素，且确定暴露与结局的时间顺序具有挑战性。为解决这些问题，本研究采用孟德尔随机化(MR)这一流行病学方法，利用种系遗传变异作为工具变量(IVs)，在满足核心IV假设（相关性、独立性、排他性）的前提下估计因果效应，同时考虑了多效性的潜在影响。此外，研究还采用中介分析来评估暴露对结局的影响如何通过中介变量传递，以阐明变量之间的潜在通路。
材料与方法
研究设计
本研究流程图如图1所示。研究从公开数据库中获取了肠道菌群、炎症细胞因子和CeVD亚型的全基因组关联研究(GWAS)汇总统计数据。通过两样本MR分析（包括正向/反向和多变量MR分析）评估这些性状之间的因果关系，最终利用中介分析揭示炎症细胞因子在肠道菌群-CeVD关联中的介导作用。本研究遵循STROBE-MR指南。
数据来源
肠道菌群组成的GWAS汇总统计数据来自FINRISK 2022队列（n=5959，欧洲血统），其基因组和宏基因组数据通过鸟枪法粪便测序生成，分析了近800万个经过严格质量控制的遗传变异，共涵盖了6个分类级别（从门到种）的209个物种水平分类群。91种炎症细胞因子的GWAS数据集来自公开的GWAS目录，源自INTERVAL队列（n=14,824，欧洲血统）。作为结局的CeVD亚型的GWAS数据集来自脑血管疾病知识门户平台，其中IS数据来自一项涉及521,612名个体的多血统GWAS，ICH和SAH的遗传变异则来自对UK Biobank和FinnGen队列的荟萃分析。
工具变量选择
研究选取与肠道菌群和炎症细胞因子显著相关的单核苷酸多态性作为IVs，显著性阈值设为p<1e-05。为减少连锁不平衡带来的潜在偏倚，应用了PLINK软件中的聚类程序。为避免弱工具变量偏倚，保留了F统计量大于10的IVs。
MR分析
本研究采用逆方差加权(IVW)荟萃回归作为主要分析方法。为减少多重比较带来的I型错误，对主要IVW结果进行了错误发现率校正。同时，还应用了其他几种MR方法，包括最大似然法、MR-稳健调整剖面评分和贝叶斯加权MR。不同方法结果的一致性支持了观察到的因果效应的稳健性。研究还进行了Cochran Q检验以评估异质性，并使用MR-Egger截距和MR-PRESSO全局检验来评估水平多效性。此外，进行了多变量MR分析，以控制可能影响结局的潜在混杂因素（如血压、吸烟、饮酒）。
中介分析
为探究肠道菌群影响CeVD的机制，研究以炎症细胞因子为中介进行了中介分析。第一步是估计基因决定的肠道菌群对炎症细胞因子的因果效应（β1），随后估计炎症细胞因子对CeVD亚型的因果效应（β2）。使用Delta方法从两样本MR分析中推导出标准误。
结果
肠道菌群与CeVD的因果关系
IVW分析在p<0.05水平上揭示了33种肠道菌群物种与CeVD之间的显著因果关系，涉及5个不同的肠道菌群门。研究发现，粪便圆柱菌、普罗文斯杆菌等4种菌的丰度增加与IS风险升高显著正相关；而阿里斯蒂普斯沙氏菌、梭状芽孢杆菌、普雷沃菌等5种菌的基因水平升高则与IS的保护作用相关。研究还探讨了14种和10种肠道菌群物种分别与ICH和SAH的因果关系，但这些关联在经过多重比较校正后失去了显著性。所有结果的F统计量均大于10，表明不存在弱工具变量偏倚。使用不同的MR方法也识别出了一致的因果关联
Cochran Q检验显示IVs间无异质性证据，MR-Egger截距和MR-PRESSO全局检验共同证实不存在方向性水平多效性。留一法分析进一步表明，排除任何单个IV都不会对结果产生实质性影响。反向MR分析未发现CeVD对肠道菌群组成有因果效应，排除了双向因果关系的可能性。敏感性分析证实了所有四种MR方法的稳健性。此外，多变量MR分析在控制了超过两个混杂因素后，识别出6种与CeVD风险显著相关的肠道菌群物种
炎症细胞因子与CeVD的因果关系
基于IVW方法的结果，研究识别出7种与IS相关、5种与ICH相关、6种与SAH相关的炎症细胞因子。例如，CD5丰度增加与ICH风险升高相关；而AXIN1、CXCL9、基质金属蛋白酶-10和程序性死亡配体1(PD-L1)水平升高被发现对ICH具有保护作用。这些结果的F统计量范围表明不存在弱工具变量偏倚
留一法分析确认没有IVs显著影响结果。然而，经过敏感性分析，由于观察到IVs的异质性和方向性水平多效性的证据，排除了5种炎症细胞因子（4种与IS相关，1种与SAH相关）。所有方法均未发现反向因果关系的证据，敏感性分析也证实了零反向MR结果的稳健性。
中介分析
中介分析量化了由炎症细胞因子介导的肠道菌群-CeVD因果通路所占的比例，具体检验了间接效应：肠道菌群→细胞因子→CeVD。分析仅纳入了在主要MR分析中显示出对CeVD有因果效应的微生物分类群和细胞因子。
研究共识别出10种中介关系。从肠道菌种嗜黏蛋白阿克曼菌B到ICH的通路分别由MMP-10和PD-L1介导，分别贡献了7.46%和7.04%的效应。此外，三种炎症细胞因子——MMP-10、PD-L1和肿瘤坏死因子——介导了多种关系。例如，MMP-10水平介导了嗜黏蛋白阿克曼菌B、GCA-900066755 sp900066755和普雷沃菌sp000436915与ICH之间的关联，中介效应分别为7.46%、8.08%和13.96%
讨论
本研究通过MR分析，识别了33种微生物分类群对CeVD的因果效应。在调整了超过两个混杂因素后，6种肠道菌群物种的因果关联仍具有统计学意义。18种炎症细胞因子表现出亚型特异性的因果效应。中介分析量化了炎症蛋白介导的肠道菌群-CeVD因果通路，其中普雷沃菌sp000436915→MMP-10→ICH构成了主要的中介效应。
研究发现，作为厚壁菌门的一个物种，粪球菌在物种水平上可能充当ICH的保护因子，但其丰度增加似乎对SAH构成显著风险。普雷沃菌属包含50多个物种，其与疾病的关系存在争议。本研究发现普雷沃菌sp002933775对IS有保护作用，而普雷沃菌sp000436915则似乎降低了SAH的风险。这些结果强调了需要从肠道菌群的角度研究不同普雷沃菌物种与特定疾病亚型的关系。
研究探讨了MMP-10、PD-L1分别与ICH的负向因果关系。已有小鼠模型研究表明MMP-10能显著缩短颅内再灌注时间、减小梗死面积，且与组织纤溶酶原激活剂相比出血时间更短、颅内出血事件更少，这支持了MMP-10是ICH保护因子的结果。PD-L1作为关键的免疫调节剂，已被证明可以减轻脑出血后的继发性脑损伤。动物实验也证明，PD-L1能改善炎症环境，增强血脑屏障，减少ICH模型小鼠的脑水肿和出血量。这些证据支持了MMP-10和PD-L1是ICH发生保护因子的结论。
研究识别了嗜黏蛋白阿克曼菌B到ICH的通路由MMP-10和PD-L1介导的中介关系。虽然每个介导因子的单独贡献看似有限，但这些结果与现有关于肠道菌群在疾病中复杂作用的研究相符。重要的是，当多个中介因子共同考虑时，总的中介效应可以得到显著增强。这突显了MMP-10和PD-L1作为由嗜黏蛋白阿克曼菌形成的保护网络中的关键节点的潜力。这些统计关联似乎与生物学证据一致。MMP-10已被确定为驱动动脉粥样硬化的关键分子，而PD-L1在ICH后的神经保护中起着核心作用。嗜黏蛋白阿克曼菌通常被视为长寿相关细菌的一员，已被证明可通过促进肠道菌群内部的平衡，对多种慢性疾病有益。可以推断，嗜黏蛋白阿克曼菌B对CeVD发展的保护作用可能源于MMP-10和PD-L1的释放。
本研究有几个优势。首先，与先前研究相比，我们的MR分析在更具体的肠道菌群物种水平上进行。其次，我们通过中介分析构建了由炎症细胞因子介导的从肠道菌群到CeVD的因果通路，部分阐明了CeVD的发病机制。第三，应用多样化的MR方法结合敏感性分析增强了研究结果的稳健性。当然，研究也存在一些局限性。例如，主要GWAS数据集的参与者多为欧洲血统，对其他种族的适用性需谨慎解读；以及未能使用更大的MiBioGen联盟数据进行验证等。
结论
总而言之，通过MR分析，我们探索了肠道菌群、炎症细胞因子与CeVD之间的因果关系。进一步的中介分析揭示了炎症因子在连接肠道菌群与CeVD的通路中充当了中介角色。这些生物标志物有望为理解CeVD的潜在机制提供新的见解，并促进针对CeVD的靶向预防和治疗策略的开发。
