NF-κB转录因子RelA调控黏膜相关恒定T细胞发育的关键机制及其上游LUBAC通路的作用

《IMMUNOLOGY AND CELL BIOLOGY》：The NF-κB transcription factor RelA directs mucosal-associated invariant T-cell development

本研究揭示NF-κB家族转录因子在调控黏膜相关恒定T（MAIT）细胞发育中的关键作用。文章通过基因工程小鼠模型证实，经典NF-κB通路成员RelA对MAIT细胞的胸腺发育至关重要，而NF-κB1则发挥抑制性作用。研究进一步发现，线性泛素链装配复合物（LUBAC）作为NF-κB信号的上游调控者，其组分Hoip和Hoil的缺失同样会损害MAIT细胞发育。这些发现将RelA和LUBAC确定为控制MAIT细胞池建立的关键转录网络组成部分，为理解这类固有样T细胞的分化调控提供了新见解。

　　

NF-κB家族成员差异性调控MAIT细胞的胸腺发育

研究团队通过检测缺乏经典NF-κB家族成员的小鼠，系统评估了不同因子对MAIT细胞胸腺发育的影响。结果显示，NF-κB1的缺失导致胸腺MAIT细胞频率显著增加，但细胞数量无显著变化，提示NF-κB1在正常MAIT细胞发育中起抑制作用。c-Rel的缺失对MAIT细胞发育没有明显影响。相比之下，在T谱系细胞中特异性缺失RelA（通过Lck^creRela^fl/fl系统）会导致MAIT细胞频率和数量均显著减少，表明RelA对MAIT细胞的个体发生至关重要。这些结果在图1a-c中通过流式细胞术数据得以清晰展示。此外，研究人员利用CD24和CD44的表面标志物差异表达，定义了MAIT细胞发育的三个阶段（S1: CD24⁺CD44^-； S2: CD24^-CD44^-； S3: CD24^-CD44⁺）。分析发现，Nfkb1^-/-小鼠中MAIT细胞的增加对应于成熟S3期细胞的轻微但显著的扩张（图2a），而RelA的缺失则导致更少的MAIT细胞达到S3期，S1和S2期细胞相应增加（图2b）。研究还探讨了替代NF-κB通路的作用，发现缺乏NF-κB2也会导致成熟S3期MAIT细胞减少（图1d， 图2c），这可能反映了MAIT细胞外在的基质缺陷。

成熟的MAIT细胞在外周维持对NF-κB蛋白的需求

胸腺选择后，MAIT细胞迁移至肝脏和外周淋巴组织等外周组织。研究发现，NF-κB1和c-Rel对于MAIT细胞在次级淋巴器官中的维持 largely dispensable，尽管NF-κB1缺陷小鼠的肝脏中MAIT细胞频率有适度但显著增加，这与胸腺中的增加趋势一致（图3a， b）。与胸腺数据一致，Lck^creRela^fl/fl小鼠脾脏、淋巴结和肝脏中的MAIT细胞频率均低于对照（图3c）。为了区分是胸腺输出减少还是外周生态位填充能力缺陷，研究者构建了由RelA缺陷胎儿肝细胞（Rela^-/-HSC嵌合体）重组的造血干细胞嵌合体。结果显示，与用野生型胎儿肝细胞重组的对照相比，Rela^-/-HSC嵌合体的外周MAIT细胞频率降低，这与在NKT细胞中观察到的减少类似。这些数据支持了RelA在MAIT细胞发育中的T细胞内在需求，尽管不能排除RelA在CD4⁺CD8⁺双阳性胸腺细胞介导的MAIT细胞选择中的支持作用。

MAIT细胞成熟受NF-κB RelA调控

除了三阶段胸腺发育途径，MAIT细胞还会功能分化为T-bet⁺MAIT1和RORγt⁺MAIT17细胞。研究使用Slamf7 (CD319) 和CD138作为这些亚群的替代标志物进行分析。NF-κB1对于MAIT细胞分化为MAIT1或MAIT17是可有可无的，因为Nfkb1^+/+和Nfkb1^-/-小鼠中CD319⁺和CD138⁺MAIT细胞的频率相当（图4a）。相比之下，RelA似乎主要参与外周组织中CD319⁺(MAIT1)细胞的维持（图4b）。RelA缺陷小鼠胸腺、脾脏和肝脏中CD319⁺MAIT1细胞的频率（图4b）和总数（图4c）均减少，而CD138⁺MAIT17细胞区室基本未受影响，除了胸腺中这些细胞数量的减少。尽管存在这种明显的MAIT1/MAIT17分化偏向（由CD319和CD138替代标志物表达定义），但来自Lck^creRela^fl/fl小鼠的脾脏MAIT细胞在用PMA和离子霉素刺激后，仍保留产生IFNγ或IL-17A的能力（图4d）。这表明RelA对MAIT细胞亚群分化和成熟很重要，但不一定是胸腺后效应细胞因子产生所必需的。

RelA的缺失并不妨碍MAIT细胞的抗原特异性激活和扩增

鉴于在Lck^creRela^fl/fl小鼠和Rela^-/-HSC嵌合体中MAIT细胞均显著减少，研究者接下来检测了RelA缺陷的MAIT细胞是否保留对抗原刺激的反应能力。将来自Lck^creRela^wt/wt和Lck^creRela^fl/fl小鼠的脾细胞在存在或不存在同源抗原5-OP-RU的情况下培养7天。尽管基线频率较低，但来自Lck^creRela^fl/fl小鼠的MAIT细胞在刺激后的平均扩增（倍数变化）达到23倍，而对照约为8倍（图5a）。然而，即使考虑到RelA缺陷MAIT细胞的增强扩增，5-OP-RU刺激后的Lck^creRela^wt/wt脾脏MAIT细胞比例仍高于Lck^creRela^fl/fl脾脏。此外，TCR参与的标志物，如CD44表达或TCRβ下调，在两组之间具有可比性（图5b）。这些数据表明，MAIT细胞响应同源抗原的能力不依赖于RelA，由此推断，RelA缺失导致的MAIT细胞成熟改变可能并非由于TCR反应缺陷。

T细胞中E3泛素连接酶Hoil和Hoip的缺失会降低MAIT细胞频率，但接头蛋白Sharpin的缺失则不会

线性泛素链装配复合物（LUBAC）由两个E3泛素连接酶Hoil和Hoip以及接头蛋白Sharpin组成，介导M1连接的线性泛素化，是通过NEMO线性泛素化激活经典NF-κB信号的上游调节因子。研究使用在T细胞中特异性缺失Hoip或Hoil的小鼠（分别为Cd4^creHoip^fl/fl和Cd4^creHoil1^fl/fl），或具有导致Sharpin提前终止的慢性增生性皮炎（cpdm）突变的小鼠（Sharpin^cpdm/cpdm），检测了LUBAC在MAIT细胞发育中的作用。Hoip或Hoil的缺失导致外周MAIT细胞频率受损，胸腺MAIT细胞发育也有减少（尽管不显著）。相比之下，功能丧失的Sharpin^cpdm/cpdm突变对胸腺MAIT细胞发育或外周MAIT细胞数量没有显著影响（图6a–c）。这些数据共同表明，Hoil和Hoip在MAIT细胞成熟和功能中发挥着关键作用，而与Hoip和Hoil形成复合物的接头蛋白Sharpin的功能丧失则影响较小。

讨论

NF-κB通路参与包括非常规T细胞在内的多种免疫细胞类型的发育和功能。本研究将这一范式扩展到MAIT细胞，揭示了个别NF-κB家族成员的不同作用。NF-κB1通常以其同源二聚体形式被视为NF-κB信号的负调节因子，似乎在NKT和MAIT细胞发育中具有不同作用。虽然NF-κB1的缺失先前被证明会导致NKT细胞发育减少，但本研究相反地观察到缺乏该因子时MAIT细胞发育增加。这种差异效应表明NF-κB1具有T谱系特异性功能，可能通过与转录共调节因子（如CREB结合蛋白）的不同相互作用介导，在NKT细胞中正向调节转录，但在MAIT细胞中作为转录抑制因子，暗示不同NF-κB家族成员在非常规T细胞中具有背景特异性的作用。NF-κB2的缺失也对MAIT细胞发育产生负面影响，尽管传统上替代NF-κB通路与淋巴器官结构和基质细胞发育相关。在NKT细胞发育中，替代通路支持基质细胞功能的作用已有报道。因此，NF-κB2缺陷小鼠中MAIT细胞发育受损可能反映了MAIT细胞外在的基质缺陷。

观察到的表型是RelA缺失导致MAIT细胞严重缺失，这让人联想到其对NK1.1^-向NK1.1⁺NKT细胞成熟的影响，以及较小程度上对γδ17 T细胞分化的影响。值得注意的是，RelA缺陷的MAIT细胞在体外仍保留响应同源抗原扩增的能力，表明RelA不是这些细胞中TCR介导的激活所必需的。这种发育能力和功能能力之间的分离表明，RelA可能不是由外周的同源抗原反应所激活，而是在胸腺发育期间被非TCR信号激活。鉴于非常规T细胞准备通过TCR和非TCR信号被激活，RelA的缺失可能通过细胞因子或固有的病原体识别信号损害MAIT细胞对感染的反应，即使TCR信号完整。支持这一点的是，IL-18信号（已知的经典NF-κB通路激活剂）已被证明与MAIT细胞发育有关。IL-18的缺失会损害胸腺MAIT细胞数量并向第3阶段胸腺发育的进展，这与RelA缺失的情况相似。尽管在RelA缺陷小鼠中MAIT1群体（由CD319表达定义）减少，但仍能检测到IFNγ的产生，这支持了RelA在亚群分化而非效应功能中具有选择性需求的观点。

RelA缺陷小鼠中观察到的MAIT细胞未成熟表型也可能反映了成熟细胞的胸腺滞留和再循环改变。这将反映c-Rel在Treg发育和胸腺滞留/再循环中扮演的双重角色。在RelA缺陷小鼠中发育的MAIT和NKT细胞无法填充其外周生态位，表明RelA也调节它们共享的外周生态位的大小，尽管这可能是这些细胞胸腺产量较低的间接后果。虽然调节非常规T细胞生态位的信号尚未确立，但新出现的证据表明，肠道-胸腺轴通过微生物信号调节MAIT细胞发育。

形成LUBAC复合物的E3泛素连接酶Hoip和Hoil以及接头蛋白Sharpin，与通过NEMO导致经典NF-κB激活的上游信号相关。在T细胞中条件性删除Hoip或Hoil会导致MAIT细胞发育受损，这让人联想到RelA缺陷。相比之下，Sharpin中的功能丧失突变cpdm似乎不会显著改变MAIT细胞发育或外周淋巴器官中的频率，这与其他T细胞谱系中的观察结果一致。与此一致的是，连接酶Hoil和Hoip的缺失导致MAIT细胞中LUBAC信号完全丧失，而Sharpin的缺失仅破坏/部分消除复合物。LUBAC整合了来自多种免疫受体（包括TCR、IL-1受体、Toll样受体和TNFRSF成员）的信号，所有这些都与MAIT细胞发育有关。这些发现支持一个模型，即LUBAC介导的线性泛素化通过激活RelA依赖的经典NF-κB通路来响应细胞因子和/或微生物信号，从而促进MAIT细胞发育。更广泛地说，我们的数据符合一个更广泛的模型，即不同的经典NF-κB成员根据发育亚群的抗炎或促炎性质，差异性地控制效应样T细胞的发育或功能。例如，c-Rel是参与抗炎性胸腺来源（t）Treg细胞发育最多的转录因子，而RelA与Treg（抗炎）效应功能相关。相反，本研究表明RelA对MAIT细胞发育比c-Rel更重要。类似地，RelA对于其他（促）炎性免疫亚群的发育至关重要，而c-Rel与NKT细胞的适当功能、ILC2细胞和B细胞类别转换相关。LUBAC信号似乎促进非常规T细胞发育中的NF-κB信号，以及Treg的发育和稳态，而没有表现出个别NF-κB转录因子在不同细胞类型中的二分法。连同NF-κB非依赖性的LUBAC活性，这意味着LUBAC信号不依赖于主导的NF-κB家族成员，而是加强了既定的转录程序。NF-κB蛋白独立控制效应样淋巴细胞发育和功能的不同模式，可能为通过靶向个别转录因子来调控炎症性或调节性群体的发育和/或功能提供治疗策略。

总之，本研究证明了经典NF-κB通路转录因子RelA在MAIT细胞胸腺发育中具有非冗余的、T细胞内在的作用，替代通路成分NF-κB2的作用程度较轻。Hoip和Hoil在MAIT发育中是必需的，这与RelA的作用平行，强调了LUBAC和NF-κB信号在调控这一非常规T细胞谱系发育中的作用。连同先前涉及的转录因子如PLZF和SATB1，NF-κB RelA构成了在胸腺发育期间建立MAIT细胞效应样特性的重要转录程序的一部分。