《Cell Proliferation》：Retinoic Acid Signalling Regulates Zebrafish Tooth Germ Repair Following Injury
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本研究揭示了视黄酸信号通路在斑马鱼牙胚损伤修复中的关键调控作用。文章利用转基因斑马鱼和靶向细胞消融技术建立了牙胚损伤模型，证实外源性RA能有效促进修复，而其前体则无效。通过药理学与遗传学手段调控通路，发现RA合成限速酶aldh1a2是修复过程的关键节点。该工作为理解牙齿损伤修复的分子机制提供了新见解，并为开发潜在治疗靶点奠定了理论基础。
1 引言
人类牙齿发育是一个由上皮-间充质相互作用驱动的复杂过程。然而，牙齿的自我修复能力有限，遗传或环境因素造成的破坏可能导致牙胚发育受损，并最终导致全球范围内牙体硬组织损伤的高发病率。目前针对牙齿损伤的临床治疗主要依赖合成材料的粘接或固定修复体。因此，从分子生物学角度重新审视损伤后牙胚的修复是一个前景广阔的研究方向。
斑马鱼的咽齿由腹侧、中背侧和背侧三个不同的齿列组成。其牙齿发育经历起始、形态发生、早期细胞分化、晚期细胞分化和附着五个时空协调的阶段。与哺乳动物不同，斑马鱼牙齿的矿化表面由釉基质（一种类似釉质的原始高矿化组织）构成。斑马鱼牙齿通过顺序再生进行终生更新，这一过程在机制上与某些哺乳动物的双套牙替换类似。这一独特特性使其成为研究损伤后牙胚修复的有力模型。
分泌钙结合磷蛋白（SCPP）基因家族在牙齿和骨骼组织的形成中起着关键作用。作为P/Q-rich SCPP基因家族的一员，scpp5在斑马鱼中表现出独特的细胞类型特异性，仅在成牙谱系（内釉上皮和成牙本质细胞）中表达，而在成骨细胞中检测不到。
本研究利用了硝基还原酶（NTR）/甲硝唑（MTZ）系统，该系统通过细胞类型特异性的NTR表达实现空间控制，并通过MTZ给药实现时间调控。NTR介导的MTZ还原会产生DNA烷基化的硝基中间体，从而诱导靶向细胞死亡，同时保留邻近的NTR阴性细胞群。利用这种形态学上的简单性以及scpp5的成牙谱系特异性表达，我们采用NTR/MTZ系统实现了牙胚细胞的时空消融，从而建立了一个精确的牙胚损伤模型。
视黄酸（RA）是视黄醇（维生素A）的合成或天然衍生物，对脊索动物胚胎的发育至关重要。它在局部发挥作用，通过细胞自主（自分泌）和非细胞自主（旁分泌）机制影响产生细胞本身或邻近的靶细胞。虽然RA信号在牙发生中的作用已得到证实，但其在损伤牙胚修复过程中的作用仍不清楚。
2 材料与方法
研究使用了AB遗传背景的斑马鱼作为野生型。为构建pBluescript-scpp5:Dendra2-NTR质粒，从斑马鱼基因组DNA中克隆了scpp5的4900-bp启动子，并亚克隆到pBluescript-Dendra2-NTR载体中。将该质粒与I-SceI共同注射到AB背景胚胎的单细胞期以进行转基因。
利用MTZ处理建立了牙胚损伤模型。斑马鱼在受精后3天（3 dpf）用MTZ处理48小时。对于小分子处理，斑马鱼被培养在含有不同化合物（如RA、视黄醛、视黄醇、他拉罗唑或DEAB）的卵水中。使用热休克条件诱导转基因品系（如Tg(hsp70l:dnRARAA-p2a-DsRed; cryaa:venus)和Tg(hsp70l:aldh1a2-p2a-mCherry; cryaa:venus)）中特定基因的表达。
研究采用了多种技术方法，包括原位杂交（ISH）以检测基因表达模式，抗体染色以观察Dendra2荧光蛋白的表达，荧光原位杂交（FISH）用于共定位分析，TUNEL染色以检测细胞凋亡，茜素红染色以观察牙齿矿化情况，以及定量聚合酶链反应（qPCR）来量化基因表达水平。所有统计分析均使用GraphPad Prism 9软件进行。
3 结果
3.1 基于转基因斑马鱼品系Tg(scpp5:Dendra2-NTR)建立牙胚标记模型
首先通过原位杂交在5 dpf的斑马鱼中检测了scpp5的表达，发现其特异性表达在咽部牙胚区域。随后成功构建了scpp5:Dendra2-NTR重组质粒并建立了转基因斑马鱼品系。荧光共定位证实Dendra2阳性细胞确实是表达scpp5的细胞。对3至7 dpf的Tg(scpp5:Dendra2-NTR)斑马鱼牙胚发育的观察显示，4V1的荧光仅在3 dpf可检测到，而3V1和5V1的荧光标记从4 dpf开始可见，在6 dpf达到峰值，到7 dpf明显减弱。茜素红染色显示了牙齿附着和更替的动态过程。这些结果表明Tg(scpp5:Dendra2-NTR)转基因斑马鱼品系已成功建立。
3.2 利用NTR/MTZ系统在Tg(scpp5:Dendra2-NTR)中建立牙胚损伤模型
在成功建立转基因品系后，测试了不同浓度的MTZ以诱导牙胚损伤。在MTZ浓度≥14 mM时，抗体染色显示Dendra2标记的牙胚细胞被完全消除，且斑马鱼的存活不受影响。因此，在后续实验中，使用14 mM MTZ在3-5 dpf处理斑马鱼以建立牙胚损伤模型。TUNEL染色证实NTR表达的牙胚细胞经历了凋亡性细胞死亡。
通过抗体染色和茜素红染色监测了从修复0天到修复3天牙胚的修复过程。在MTZ组，修复3V和5V在修复2天时附着到角鳃骨上，荧光在修复1天到1.5天达到峰值，之后下降。在DMSO对照组中，3V1/5V1的附着发生得更早。此外，MTZ组中4V2的出现晚于DMSO组。对斑马鱼牙胚标记物fth1b和cx43的ISH分析显示，在MTZ处理组中，两者的表达域从修复0天到修复1天逐渐扩大。FISH分析进一步揭示，在MTZ组中，与牙齿矿化相关的基因ambn和enam的表达在修复0天到修复1天期间逐渐增加，而在DMSO组中，这些基因的表达在修复1天时下降。综上所述，研究结果确立了Tg(scpp5:Dendra2-NTR)斑马鱼作为通过NTR/MTZ系统实现靶向细胞消融的牙胚损伤模型。
3.3 损伤后视黄酸信号通路的激活
细胞内RA信号传导的主要事件包括视黄醇转化为视黄醛，进而转化为RA。为了确定RA信号在损伤后牙胚修复中的功能参与，使用qPCR分析了斑马鱼角鳃区域RA信号相关基因的表达。在修复0天，qPCR分析表明MTZ处理显著上调了18个类视黄醇通路基因，其中aldh1a2在所有RA信号基因中表现出最显著的上调。ISH显示，MTZ处理在修复0天和修复1天扩大了aldh1a2的表达域。这些数据表明，MTZ诱导的损伤触发了RA信号通路的激活。
3.4 RA（而非其合成前体视黄醇或视黄醛）有效调节损伤诱导的牙胚修复
研究发现，在没有MTZ诱导损伤的情况下，外源性RA处理不会改变Dendra2荧光强度或牙齿矿化。相比之下，在MTZ消融后从修复0天到修复1天给药，外源性RA显著增加了损伤组在修复0.5天和修复1天的Dendra2荧光强度。此外，茜素红染色显示，与对照组相比，修复1天时修复3V和修复5V的修复进程加快。在MTZ上调的18个类视黄醇通路基因中，qPCR分析显示外源性RA处理显著上调了其中8个基因，而另外10个基因未发生显著变化。值得注意的是，外源性RA处理并未影响aldh1a2的表达。
为了进一步研究内源性RA在牙胚修复中的作用，使用了他拉罗唑（TZ）处理斑马鱼，这是一种选择性的CYP26A1/CYP26B1抑制剂，可阻止内源性RA的降解。鉴于raraa对外源性RA的反应表现出最强的上调，研究采用了显性失活方法构建了Tg(hsp70l:dnRARAA-p2a-DsRed; cryaa:venus)转基因品系，该品系利用hsp70l热休克启动子驱动的显性失活RARAA突变来破坏RA下游信号传导。抗体染色和茜素红染色显示，Tg(hsp70l:dnRARAA-p2a-DsRed; cryaa:venus)转基因品系损害了牙胚损伤后的修复过程，而TZ则促进了该过程。
然而，外源性添加RA前体物质（视黄醇或视黄醛）对损伤后的牙胚修复过程没有影响。qPCR基因表达分析表明，外源性视黄醇增强了rbp4的表达，而视黄醛上调了6个基因。值得注意的是，视黄醇和视黄醛均不影响aldh1a2的表达。这些结果表明，RA在调节损伤后牙胚修复方面具有独特的功能，而不是其前体视黄醇或视黄醛，并且aldh1a2在此过程中成为RA信号通路中的关键介质。
3.5 调节aldh1a2表达调控牙胚损伤修复
为了研究aldh1a2在损伤后牙胚修复中的功能作用，我们结合了药理学抑制（使用特异性醛脱氢酶抑制剂DEAB）和遗传过表达（使用转基因品系Tg(hsp70l:aldh1a2-p2a-mCherry; cryaa:venus)）两种方法。DEAB处理降低了aldh1a2的表达，而过表达aldh1a2则增加了其表达。
抗体染色显示，DEAB显著降低了修复0.5天和修复1天的Dendra2荧光强度，而aldh1a2过表达则增强了荧光强度。茜素红染色表明，DEAB损害了牙胚修复，而aldh1a2过表达促进了修复1天时的牙胚修复。TUNEL染色揭示了对细胞凋亡的相反影响：DEAB增加了牙胚中凋亡细胞的数量，而aldh1a2过表达则减少了修复0.5天和修复1天时牙胚中的凋亡细胞。类似地，ISH分析显示，DEAB下调了cx43和fth1b的表达，而aldh1a2过表达则上调了它们在修复0.5天和修复1天的表达。与这些观察结果一致，qPCR分析表明，DEAB抑制了参与牙胚细胞分化和矿化的基因的表达，而aldh1a2过表达则增强了这些基因的表达。综上所述，这些结果表明aldh1a2活性调节损伤后牙胚修复的进程。
4 讨论
本研究证实，RA信号在介导斑马鱼NTR/MTZ诱导损伤后的牙胚修复中起着至关重要的作用。具体而言，MTZ处理后，在修复0天观察到4V1矿化受损，而3V1和5V1牙齿缺失。这种表型模式可以通过scpp5在4V1中的表达早于3V1和5V1来解释。
尽管视黄醇、视黄醛和RA是维生素A途径中的连续代谢物，但它们对斑马鱼牙胚修复的影响存在显著差异。虽然外源性RA促进修复，但视黄醇和视黄醛没有这种活性。这种功能差异与其他再生模型中的发现一致。
RA信号已被证明不仅在调控组织和器官发育中起关键作用，而且在促进特定组织的修复和再生过程中也至关重要。在哺乳动物中，RA水平的过量或不足都会导致牙齿发育的严重异常。然而，在斑马鱼牙齿发育过程中调节RA信号对牙齿数量模式产生了显著影响。在损伤后的牙齿修复或再生中，干细胞的重分化对于保持成牙潜能至关重要。先前的研究已经证实RA是早期外胚层诱导剂，可以在体外指导多能干细胞向牙上皮谱系分化。此外，RA补充增强了成牙基因的表达，并促进了培养的小鼠牙间充质细胞的成牙能力。我们的研究结果表明，RA处理促进了斑马鱼修复3V和修复5V牙胚的修复。这种效应可能归因于RA增强了常驻上皮和间充质干细胞的重分化，或源自3V2和5V2的牙胚细胞的过早发育。RA信号的复杂性反映在其情境依赖性角色上，这在发育、损伤修复和不同物种间的差异中得到了证明。
在本研究中，靶向细胞消融是通过NTR/MTZ系统实现的，其中NTR阳性牙胚细胞将MTZ转化为细胞毒性化合物，选择性地诱导细胞凋亡。在斑马鱼随后的修复阶段，这些细胞中的凋亡受到视黄酸信号通路的调节——该通路因其在再生过程中平衡细胞凋亡和组织重塑的关键作用而得到认可。RA的一个关键特征是其情境依赖性，在细胞凋亡中扮演双重角色，能够根据细胞类型、类视黄醇种类和共存的信号线索等变量促进或抑制细胞死亡。在各种癌症中，RA激活会导致生长停滞和凋亡。相反，在损伤后的组织修复和再生中，RA通常表现出抗凋亡功能。例如，在急性肾损伤模型中，RA给药减少了顺铂诱导的细胞凋亡。类似地，在成年斑马鱼鳍再生过程中，持续的RA信号通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2来增强增殖性胚基细胞的存活。RA的保护作用也在上皮和内皮环境中被观察到。与这些发现一致，我们的研究进一步支持RA信号在损伤后牙胚修复过程中对细胞凋亡的负调控作用。然而，RA介导的细胞凋亡调控的确切分子机制仍有待进一步研究。
5 结论
总之，这项工作证明了RA信号在损伤牙胚修复中的关键作用。我们的研究通过建立Tg(scpp5:Dendra2-NTR)转基因斑马鱼品系以及利用MTZ/NTR系统开发靶向斑马鱼牙胚损伤模型支持了这一假设。利用该模型，我们观察到RA信号调节牙胚修复。然而，RA信号与其他通路之间的相互作用，以及其对上皮-间充质相互作用的影响仍不清楚，值得进一步研究。总之，我们的研究结果为促进损伤后牙胚修复提供了新的见解。
