《Molecular & Cellular Proteomics》：An integrative proteotranscriptomics approach reveals new ADAM9 substrates and downstream pathways
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本研究针对ADAM9在多种疾病中的作用机制尚不明晰，其底物与下游靶点仍属未知的难题，研究人员通过开发一种整合的蛋白质组-转录组学方法，系统性地在HCT116结肠癌细胞中识别ADAM9的靶标。研究发现了ADAM9调控的mTOR和FOXO信号通路，并鉴定出ALCAM、IL10RB和IGSF8等新底物，为理解该蛋白酶在癌症、自身免疫病等疾病中的作用提供了新机制见解。
在细胞表面的信号传导与通讯网络中，有一类被称为解整合素金属蛋白酶（A Disintegrin And Metalloproteinase, ADAM）的“剪刀手”，它们负责切割（或称“脱落”）膜蛋白的胞外域，从而释放或激活关键信号分子，影响细胞的命运。ADAM9便是其中一把重要的“剪刀”，它的功能失调与多种严重疾病紧密相关：从促进实体瘤的生长与扩散，到加剧慢性阻塞性肺病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD）和自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮，甚至在年轻重症COVID-19患者体内，ADAM9的表达也被发现显著上调，可能助长了病毒的感染与复制。然而，尽管其在病理过程中的重要性日益凸显，这把“剪刀”究竟在细胞表面剪断了哪些蛋白（即其底物），以及这些剪切事件最终触发了细胞内的哪些信号通路，很大程度上仍是一个“黑箱”。这种未知不仅限制了我们深入理解ADAM9驱动疾病的分子机制，也给将其作为药物靶点进行干预带来了潜在风险——因为我们不清楚抑制它可能会意外影响到哪些正常的生理过程。
传统上，科学家们主要通过分析细胞培养上清液中的蛋白质（即分泌蛋白质组学，secretomics）来寻找这类蛋白酶的底物。但这种方法存在明显局限：一些被切割下来的蛋白片段可能并未被释放到细胞外，而是仍然附着在膜上或很快被降解；同时，上清液中蛋白质丰度的变化也可能源于转录水平的改变，而非直接的蛋白水解事件，这导致了假阴性和假阳性结果的困扰。此外，分泌蛋白质组学难以揭示底物被切割后所引发的下游基因和通路变化。为了突破这些瓶颈，一篇发表在《Molecular 》上的研究另辟蹊径，开发了一种全新的、非偏向性的整合蛋白质组-转录组学方法，系统性地描绘了ADAM9的“工作图谱”。
研究人员为开展这项研究，主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们选择具有稳定二倍体核型、适合组学分析的HCT116结肠癌细胞系，通过小干扰RNA（siRNA）技术敲低ADAM9的表达。随后，他们对对照组和ADAM9敲低组细胞进行了RNA测序（RNA-seq）和基于串联质谱标签（Tandem Mass Tag, TMT）标记的定量蛋白质组学分析。最后，他们采用双向正交偏最小二乘法（O2PLS）对转录组和蛋白质组数据进行整合分析，以区分受ADAM9转录调控和转录后调控的靶蛋白，并从后者中筛选出潜在的细胞表面底物。
研究结果
Characterizing and integrating the transcriptome and cellular proteome regulated by ADAM9 in HCT116 cells
研究人员成功敲低了HCT116细胞中的ADAM9，并进行了RNA-seq和定量蛋白质组学分析，分别检测到12,519个mRNA和6,645个蛋白质。数据分析显示，ADAM9敲低样本与对照组在转录组和蛋白质组水平上均能清晰区分。通过整合两组数据并利用O2PLS分析，他们系统鉴定出了受ADAM9转录调控和转录后调控的蛋白质靶标，为后续筛选底物和解析下游通路奠定了基础。
mTOR and FOXO signaling pathways are downstream of ADAM9 in HCT116 cells
通过对差异表达基因进行KEGG通路富集分析，研究人员发现ADAM9敲低显著影响了多个与Akt激酶相关的通路，包括PI3K-Akt、mTOR和FOXO信号通路。进一步分析证实，ADAM9敲低后，蛋白质水平的FOXO3显著上调，而其mRNA水平未变，表明这是转录后调控。免疫细胞化学实验显示，ADAM9敲低导致细胞核内FOXO3水平增加。同时，已知的FOXO3靶基因（如MUC13、THBS1和GDA）的mRNA表达也随ADAM9敲低而上调。这些结果表明，ADAM9在HCT116细胞中抑制了肿瘤抑制通路FOXO信号。结合已发表的研究（该团队此前工作），ADAM9也促进致癌的mTOR信号通路。因此，ADAM9通过同时激活mTOR和抑制FOXO信号，协同促进肿瘤进展。
Identifying candidate substrates for ADAM9 from post-transcriptional targets
基于“ADAM9敲低后，其底物应在细胞膜上积累”的假设，研究人员从与ADAM9负相关且受转录后调控的差异表达蛋白质中，筛选出64个定位于细胞表面的膜蛋白作为ADAM9的潜在底物候选者。这些蛋白包括35个单次跨膜蛋白、26个多次跨膜蛋白和2个糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白。
ALCAM, IL10RB and IGSF8 are ADAM9 substrates
研究人员从中选择了ALCAM、IGSF8和IL10RB进行验证。实验表明，敲低ADAM9会减少培养基中脱落的ALCAM胞外域，同时增加细胞裂解物中的全长ALCAM蛋白；而过表达野生型ADAM9（而非其蛋白酶失活突变体E348A）则能增强ALCAM的脱落。即使在ADAM17基因敲除的细胞中，野生型ADAM9仍能促进ALCAM脱落，证明该过程不依赖于ADAM17。因此，ALCAM是ADAM9的直接底物。对于IGSF8，敲低ADAM9抑制了其脱落，但过表达野生型和突变型ADAM9都能促进其脱落，这表明IGSF8可能是ADAM9的间接底物。对于IL10RB，敲低ADAM9会上调其全长蛋白水平。虽然在其培养基中未检测到脱落的胞外域，但在过表达野生型ADAM9（而非E348A突变体）的细胞裂解物中发现了该片段，提示IL10RB被切割后，其胞外域可能仍滞留在细胞表面或发生内化。这些结果验证了ALCAM、IGSF8和IL10RB是ADAM9的新底物。
研究结论与意义
本研究成功开发并应用了一种整合蛋白质组与转录组学的新方法，系统性地揭示了ADAM9的下游信号网络和底物谱。研究不仅证实了ADAM9通过调节致癌的mTOR通路和抑癌的FOXO通路影响细胞命运，更重要的是，鉴定出了三个新的ADAM9相关底物：ALCAM、IGSF8和IL10RB。这些发现具有多重重要意义：首先，新发现的底物在疾病中扮演关键角色，例如ALCAM和IGSF8与实体瘤进展相关，IL10RB则在COPD、COVID-19和自身免疫疾病中上调，这为理解ADAM9在多种疾病中的具体作用机制提供了直接线索。其次，研究验证了该方法能够发现传统分泌蛋白质组学可能遗漏的底物（如IL10RB），证明了整合多组学策略在底物筛选中的优越性和必要性。最后，该研究为ADAM9作为癌症、炎症性疾病等的潜在治疗靶点提供了更坚实的理论基础和更丰富的干预视角，同时提示在靶向ADAM9进行治疗时，需考虑其对FOXO等抑癌通路的影响，以全面评估疗效与安全性。这项工作不仅增进了对ADAM9生物学功能的理解，也为研究其他膜蛋白酶提供了一套可借鉴的高通量、系统性研究框架。
