《Environmental Microbiology》：Exploring the Habitability of the Outer Solar System Icy Moons for the Extremotolerant Yeast Rhodotorula frigidalcoholis
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本文综述了嗜冷酵母Rhodotorula frigidalcoholis在模拟木星和土星冰卫星（如欧罗巴和恩克拉多斯）极端环境（脱水、多色UV和X射线复合胁迫）下的生存能力和转录组学响应。研究证实该酵母具备卓越耐受性，并揭示了其在胁迫期间及修复过程中基因表达的动态变化，特别是与催化活性和DNA修复相关的基因被快速激活。这项工作增进了我们对耐冷微生物在极端环境下生存机制的理解，并为未来（如JUICE和Europa Clipper）冰卫星生命探测任务的行星保护策略提供了关键见解，强调了在考量中纳入酵母的重要性。
引言
嗜冷和耐冷微生物因其能在0°C以下生长的独特能力，成为研究生命如何在太阳系冰卫星上存活的理想对象。随着欧洲空间局（ESA）的JUICE和美国国家航空航天局（NASA）的Europa Clipper任务对木星系统的探索兴趣重燃，识别能在冰卫星上存活的生物变得尤为重要。本研究选择了极端嗜冷酵母Rhodotorula frigidalcoholis作为研究对象，因其具备在30°C至-10°C间生长的固有能力，并能耐受一系列极端条件，包括X射线、UV-C和多色UV辐射、不同温度下的脱水以及冻融循环。我们报告了R. frigidalcoholis在模拟冰卫星条件下的存活情况，并利用转录组学方法，揭示了其在暴露于复合冰卫星条件前、中、后的差异基因表达新见解。我们还识别了暴露期间参与催化活性和DNA修复基因的快速激活。这些结果有助于更好地理解耐冷微生物在极端环境中的生存机制，并能为未来在恩克拉多斯和欧罗巴等卫星上的生命探测任务提供信息，同时也凸显了在行星保护工作中考虑酵母的必要性。
冰卫星，如土星的恩克拉多斯和木星的欧罗巴，是表面覆盖着冰层、其下可能存在与地球相似的次表层海洋的天体。卡西尼-惠更斯任务通过分析从卫星表面冷羽流喷出的物质，在表征这些环境方面发挥了关键作用。这些卫星的潜在宜居性因素还包括厚达数公里的冰壳，它能屏蔽辐射强烈的外部环境对次表层海洋的影响，以及海洋的内部加热机制。
鉴于冰卫星的环境条件，嗜冷和耐冷微生物是研究生命在此类环境中生存和繁衍潜力的理想候选者，因为它们能在水的冰点以下生长。北极和南极地区已知拥有多样的微生物群落，最近的研究显示其包含大量真菌物种，突出了此类微生物对极端条件的适应性。
酵母Rhodotorula frigidalcoholis（原名JG-1b）是一种从南极环境中分离出来的耐冷生物，能在低于0°C的温度下生长。该酵母在最小培养基中培养后，已证明能耐受一系列极端条件，包括X射线辐射、UV-C和多色UV辐射、脱水及冻融循环。我们的研究表明，与几种细菌物种相比，R. frigidalcoholis对极端条件表现出更强的耐受性。据推测，红酵母属物种常见的类胡萝卜素色素生产可能有助于其抗辐射性，特别是在其原生南极栖息地的高UV通量环境下。此外，Touchette等人的转录组分析揭示了R. frigidalcoholis在0°C与23°C下生长时的代谢变化。这些发现确立了R. frigidalcoholis作为研究模拟冰卫星条件下代谢反应的强大模式生物。
实验方法
样本生长与暴露
酵母菌株由加拿大蒙特利尔麦吉尔大学的Whyte教授提供。首先在通用酵母培养基（UMY）中于25°C、125 rpm轨道摇动下生长至指数后期，然后接种到含有0.2% (w/v) L-谷氨酸作为碳源的M9完全最低盐培养基（M9-谷氨酸）中。暴露于冰卫星条件共使用三组样本，每组四个生物学重复，所有暴露条件均在室温下进行，包括脱水、多色UV和X射线辐射。对照组（在M9-谷氨酸中生长）、暴露组（在M9中生长并暴露于模拟冰卫星条件）和修复组（暴露后所有样本在液体培养基中于25°C孵育4小时）。将酵母培养物置于无菌的1厘米玻璃圆盘上，在室温（相对湿度40% ± 10%）下干燥过夜，并在相同无菌条件下储存7天。UV暴露使用500S照射源（Dr. Hoenle AG），在100厘米距离下进行不同剂量（500至7500 J/m2）的多色UV辐射。随后，将圆盘转移至Gulmay RS 225A X射线源，在200 kV和15 mA下进行电离辐射暴露（剂量率30 ± 5 Gy/min）。暴露后，通过涡旋将酵母样本重悬于无菌PBS中，用于通过菌落形成单位（CFU）计数确定存活率以及RNA分离。
为分析RNA并确定暴露后的生长动力学，将细胞重悬于25°C的100 mL M9-谷氨酸培养基中。通过每隔一小时进行连续稀释平板和CFU计数来确定孵育期间酵母的生长动力学。观察到CFU计数在5小时后增加，从而为修复条件下的RNA分离选择了4小时的时间点，以避免捕获新生子代细胞的转录本，而是专注于暴露后主动修复的转录本。
RNA分离、测序与生物信息学分析
RNA分离采用苯酚-氯仿法。使用安捷伦4200 TapeStation确保RNA质量。随后将RNA样本干冰运输至德国莱比锡的GENEWIZ德国公司进行RNA测序和初步分析。进行Illumina下一代测序，每个样本3000万reads。使用Trimmomatic修剪序列读数，然后使用STAR比对器将修剪后的reads映射到Rhodotorula_JG-1b参考基因组。使用featureCounts提取唯一的基因命中数。下游差异基因表达分析（DGEA）使用DESeq2进行，将调整后p值 < 0.05且绝对log2倍数变化 > 1的基因定义为差异表达基因（DEG）。为了可视化全局转录模式，创建了火山图和主成分分析（PCA）图。使用NCBI数据库将参考基因组基因转换为直系同源群簇（COG）类别，并评估DEG在COG类别中的分布。使用Venn图分析样本间共享的DEG。使用FungiFun3工具对显著的DEG进行基因集富集分析（GSEA）。使用所有三个样本比较中识别出的DEG生成聚类热图。使用UniProtKB搜索功能识别抗性基因。
结果
对复合条件的存活率
先前研究表明R. frigidalcoholis对单一极端条件具有显著的耐受性。在此基础上，酵母随后暴露于多种胁迫因子的组合中。值得注意的是，它也能够在脱水、X射线和多色UV（200–400 nm）辐射的复合暴露下存活。暴露方案按顺序进行以确保损伤累积。所有样本均暴露于7天脱水以及递增的X射线和UV辐射方案。其生存极限为7天脱水、750 Gy X射线辐射和7500 J/m2多色UV辐射。为评估存活所需的代谢变化，需确保R. frigidalcoholis在复合条件暴露后能恢复正常生长。因此，在暴露于最高剂量的复合条件后，将干燥样本重悬于PBS中并在25°C的最小培养基中孵育。每1小时取一次生长样本等分试样，持续5小时，并在22小时取样，通过CFU平板计数测量细胞分裂。基于观察到的生长动力学，选择补水后4小时的时间点进行RNA提取。
极端条件下的基因表达
为确定条件内重复性和条件间差异，进行了多次主成分分析（PCA）。结果显示，暴露组与修复组之间的比较差异最大，两个条件间PC1的方差最强（69%）。各比较中已知的显著DEG总分布显示，对照组与暴露组、暴露组与修复组的比较中DEG数量高于对照组与修复组的比较。此外，除暴露组与修复组外，其他两个比较中下调的DEG数量超过了上调的数量。
尽管暴露组与修复组的比较显示出最高的显著DEG总数，但火山图显示其log2倍数变化分布比对照组与暴露组、对照组与修复组的比较更窄，表明基因表达变化多样性较低但统计学显著性更高。然而，基于-log10（调整后p值），暴露组与修复组表现出最广泛的上下调DEG分布。应用排序标准时，发现最显著的上调和下调基因并非在所有比较中一致共享。然而，编码主要促进子超家族（MFS）底物转运蛋白的基因，负责跨细胞膜运输一系列分子，在所有比较中始终位列最显著上调的DEG之中。
R. frigidalcoholis基因组中直系同源群簇（COG）的分布显示，很大比例的基因功能未知。在已注释的基因中，大多数属于参与转录的K类，其次是参与翻译（包括核糖体生物合成）的J类。正如预期，大量基因也与脂质转运和代谢（I类）以及氨基酸转运和代谢（E类）相关。
检查三个成对比较中DEG在COG类别中的分布时，上下调基因数量最多的是与转录相关的类别。对照组与修复组比较中观察到的DEG数量相对较少，这在图中较短的橙色条上得到体现。各比较中DEG在COG类别中的上下调分布趋势不均衡，只有很少类别在两个方向上显示出平衡的基因数量。例如，在对照组与暴露组的比较中，更多上调基因属于J类（翻译、核糖体结构和生物合成），而在暴露组与修复组的比较中，这一趋势发生逆转，同一类别中更多基因被下调。
有趣的是，某些COG，如辅酶转运和代谢（H）、细胞壁/膜生物合成（M）、翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣（O）以及细胞内运输、分泌和囊泡运输（U），在对照组与暴露组和暴露组与修复组的比较中显示出几乎相等的上下调基因分布。这表明这些类别中的基因表达可能在暴露和恢复期间受到一致调节，突出了酵母在胁迫响应中主动参与的关键细胞过程。
为识别条件间共享的基因并识别表达趋势，进行了DEG的成对比较。该分析显示，所有三个比较共享300个DEG。其中，31个基因持续上调，81个基因持续下调，其余188个基因共享但显示出相反的表达模式。正如预期，暴露组与修复组和对照组与暴露组之间的比较显示出最高数量的共享基因，反映了这些比较中较高的DEG总数。总体而言，在共享基因中，大多数是下调的，这与除暴露组与修复组外的各个比较中观察到的总体表达趋势一致，后者模式相反。
尽管共享基因中COG类别的分布通常遵循所有DEG中观察到的总体趋势，但存在显著差异。与完整数据集一样，共享基因数量最多的仍然与转录（K）相关。然而，有几个COG类别在某些比较中缺失。具体而言，与RNA加工和修饰（A）、细胞周期控制、细胞分裂、染色体分离（D）、翻译、核糖体结构和生物生成（J）、翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣（O）、防御机制（V）和细胞骨架（Z）无关的暴露相关基因。与所有DEG的总体COG分布相比，共享基因表现出更强的下调趋势，如图所示。这种模式表明，许多跨比较共享的基因，即使调控方向不一致，也往往更频繁地被下调。尽管COG类别频率存在这些差异，共享基因的功能谱在个体比较中仍然基本相似。大多数仍然与关键的代谢和调控功能相关，特别是辅酶转运和代谢（H）、信号转导机制（T）以及碳水化合物转运和代谢（G）。
基因集富集分析
使用FungiFun3工具进行的基因集富集分析（GSEA）揭示了样本间过度或不足代表的通路。分析显示，对照组与暴露组的比较涉及94条通路，暴露组与修复组涉及101条通路，对照组与修复组涉及35条通路。对照组与暴露组的归一化富集分数（NES）在4.11至-2.02之间，上调的通路反映了蛋白质合成（核糖体生物发生、核腔、核仁），而下调的通路与细胞结构成分（微管细胞骨架、细胞壁组织）和生物合成过程（双加氧酶活性、微管马达活性）相关。然而，强富集的上调和下调通路的基因计数低于富集较弱的通路（水解酶活性、细胞过程、细胞内非膜结合细胞器、细胞内解剖结构）。
与对照组与暴露组相反，对照组与修复组比较中识别的通路较少，表明酵母在两种条件下执行的功能相似。这也得到了通路中使用的基因数量少（阴离子结合）和低富集分数（氨基酸合成）的支持。尽管如此，对照组与修复组显示出总体正富集，35条通路中有30条上调。该比较中与基线活性相关的通路性质也可通过其功能识别（氨基酸生物合成过程、氧化还原酶活性、阴离子结合、连接酶活性）。
暴露组与修复组中高数量的通路以及基因大小 > 100的通路数量众多，反映了两条件间执行活动的差异。GSEA还强调了催化活性是本研究中所有比较中涉及基因数量最多的通路。尽管在对照组与暴露组中识别出多条通路，但暴露组与修复组NES范围的逆转显示了两比较间代谢功能的差异。在此比较下，核糖体生物发生和蛋白质合成下调（核糖核蛋白复合物、核糖体、核糖体亚基、核仁），而催化和磷酸化机制，包括DNA修复，则上调（有机底物代谢过程、初级代谢过程、磷酸化、转移酶活性、激酶活性）。
来自GSEA突出通路中涉及基因的聚类热图支持了我们的发现。例如，核糖体生物发生和蛋白质合成基因仅在对照组与暴露组中上调，而DNA修复和水解基因（如DNA光解酶和α/β水解酶）的重要性则与其他红酵母属物种共享。基因聚类还揭示了许多基因在通路间共享（酰基-CoA氧化酶、糖苷水解酶），突出了它们的作用。
脱水与辐射抗性基因表达模式
使用UniProtKB对R. frigidalcoholis基因组的调查揭示了几种可能支持对多种极端条件抗性的基因直系同源物。这些基因在其他表现出耐受脱水或辐射的生物体中被识别。搜索在所有样本条件下差异表达的此类“抗性基因”共72个，其中53个与辐射相关，19个与脱水相关。有趣的是，尽管所有基因都引发了响应，但只有对照组与暴露组的比较显示出更高的log2倍数变化。此外，在对照组与暴露组下，大约一半的辐射抗性基因和一半的脱水抗性基因被上调。然而，log2倍数变化最高的DEG可见于顶部，如RHOSPDRAFT_31273 (LPX1)、RHOSPDRAFT_31279 α/β水解酶 (LPX2) 和RHOSPDRAFT_33214 端粒保护蛋白1 ssDNA结合域包含蛋白 (POT1)，与其他所有DEG分开聚类并与脱水耐受性相关。总体而言，这些结果支持了GSEA分析，并进一步巩固了对R. frigidalcoholis在暴露条件下与对照组或修复组相比如何保持代谢活跃的理解。
讨论
先前研究已显示R. frigidalcoholis的恢复力；特别是，它们突出了其在零下温度生长的能力以及对极端环境条件的耐受性。然而，这种酵母及其他微生物在类似冰卫星条件下的生存和代谢活性仍很大程度上未被探索。多种环境胁迫因子对微生物生存的多因素效应仍知之甚少。考虑到JUICE和Europa Clipper航天器计划最终撞击木星最大卫星——也是整个太阳系最大卫星——木卫三（盖尼米得），这一知识缺口尤为重要。尽管选择木卫三作为撞击地点是基于其表层海洋不与表面相互作用的假设，但如果有新证据表明情况并非如此，这一任务结束决定可能改变。因此，研究冰卫星条件如何影响耐冷微生物至关重要，它们是最有可能在此类环境中存活的陆地生命形式。选择R. frigidalcoholis作为模式生物还得到其固有适应能力的进一步支持，例如在高渗透压（水结冰时发生）下细胞内渗透压保护剂的积累，以及维持膜流动性。
真菌在空间生物学背景下的研究正在增长；然而，大多数研究集中于微生物对辐射的响应，很大程度上因为真菌是辐射耐受性最强的真核生物之一。迄今为止，大多数酵母研究都集中在研究充分的酵母属，特别是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。例如，据报道，酿酒酵母可耐受高达60 Gy的类似银河宇宙射线（GCR）的粒子电离辐射。相比之下，我们的发现显示R. frigidalcoholis对更高剂量的电离辐射表现出显著更高的耐受性，表明它可能是在此类条件下空间生存的更稳健候选者。支持测试多种胁迫因子的重要性，早期对酿酒酵母椭圆变种的研究报告了暴露于750 Gy γ辐射和60°C短暂热休克后的存活，强调了研究协同胁迫效应的必要性。此外，环境酵母分离株，如粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、Dioszegia fristingensis和Cystofilobasidium macerans，也因其对UV辐射的耐受性而被研究。然而，这些研究并未专门考察与空间相关的DNA损伤性UV-C辐射的影响。虽然某些酵母物种的脱水耐受性已被研究，但这些研究通常显示在营养有限条件下存活有限且无生长。尽管如此，其他真菌候选者，如黑色真菌Cryomyces antarcticus和Rhinocladiella similis，已被用于通过暴露于Fe粒子辐射和与火星风化层模拟物相互作用来评估火星的地外宜居性。此外，对耐盐酵母Debaryomyces hansenii的蛋白质组学分析也显示了其在火星卤水条件下对高氯酸盐胁迫的恢复力。综上所述，我们的结果表明，R. frigidalcoholis是一个极具前景（且可能更优）的空间生存候选者，因为它对多种空间相关胁迫因子（包括辐射、脱水和营养限制）具有卓越的抗性。
酿酒酵母的基因组大小约为12 Mbp，对其参考菌株S288c的研究表明，只有约6%的基因功能未表征。相比之下，尽管R. frigidalcoholis的基因组更大，但它包含53%功能未知的基因，这凸显了该生物体相对研究不足的程度。大量未知基因也反映在我们的转录组分析中，很大一部分DEG缺乏已知功能注释。这些未知的DEG可能在模拟冰卫星条件下的胁迫响应和生存中发挥重要作用，突出了未来功能研究的必要性。
在已知的DEG中，大多数上下调基因与转录和翻译相关。这表明在暴露和恢复期间，这些核心过程发生了显著变化。特别是，暴露组与修复组的比较显示翻译相关基因显著下调，可能表明细胞周期暂时停滞。这种停滞是一种已知的胁迫响应。例如，皮炎外瓶霉（Exophiala dermatitidis）在γ照射后暂停细胞分裂，以便在恢复生长前进行DNA修复。R. frigidalcoholis中可能发生了类似机制，恢复期间翻译、核糖体生物发生和DNA复制相关基因的下调表明了为保持基因组完整性而进行的协调响应。
同时，暴露组与修复组条件下编码具有催化活性酶基因的上调表明，R. frigidalcoholis激活了生化修复过程。这些酶对于酵母和人类中的双链断裂（DSB）修复至关重要。能量生产相关基因表达的增加进一步支持了这一点，表明在胁迫期间优先进行能量密集的修复过程。在工业酵母的酒精发酵过程中也观察到了类似的响应。
质膜损伤也可能阻止细胞周期进程。这包括脱水、电离辐射、DNA损伤（如嘧啶二聚体和DSB）以及由UV和电离辐射触发的活性氧（ROS）产生所造成的损伤。在酿酒酵母中，膜损伤与DNA复制抑制和保存机制的激活直接相关。鉴于我们实验中施加的胁迫因子的严重性，R. frigidalcoholis很可能经历了类似的膜破坏。尽管组成不同，研究表明即使低于此处使用的X射线辐射剂量也能损伤真核细胞膜。
有趣的是，尽管推测需要信号传导来启动修复和停滞生长，但我们观察到与信号转导相关的DEG显著下调。这可能表明R. frigidalcoholis在极端胁迫下信号通路失调。在酿酒酵母中，已知DNA损伤检查点会延迟有丝分裂以允许修复，这可以解释我们的发现。
实验设计旨在捕获恢复期间DNA修复通路的激活。出乎意料的是，几个关键的修复基因在暴露期间，即细胞脱水时，就已经上调。这些包括DNA光解酶、LPX2、POT1、RAD50、MRE11、Ku70和Ku80。这表明暴露诱导了嘧啶二聚体和DSB，这得到了同源重组（RAD50， MRE11）和非同源末端连接（Ku70， Ku80）通路激活的支持。DNA光解酶（特异性修复环丁烷嘧啶二聚体）的上调进一步支持了这一点。端粒保护基因POT1表达的增加强调了细胞为维持基因组稳定性所做的努力。
