利用丝质微针贴片实现超声激活的细胞焦亡，用于癌症免疫治疗

《Nano Today》：Ultrasound-activated pyroptosis using silk microneedle patch for cancer immunotherapy

本研究开发了一种超声激活的2D Cu-TCPP纳米片与丝心蛋白微针复合的CuT-MN平台，通过超声能量驱动纳米片产生活性氧（ROS），激活Caspase-3/GSDME通路诱导焦亡，重塑免疫抑制性肿瘤微环境并增强抗肿瘤免疫应答。该平台通过微针实现精准肿瘤靶向递送，解决传统给药方式清除快、蓄积不足的问题，显著提高局部ROS浓度并降低副作用。

　　

张明|李一凡|唐宏宇|李明轩|沈美芳| Bing铁军|余英杰|王玉书|胡文豪

北京大学国际医院病理学系，中国北京102206

摘要

癌症免疫疗法受到免疫抑制性肿瘤微环境的限制，这限制了免疫激活并影响了治疗效果。焦亡是一种由Caspase依赖性的gasdermin切割介导的促炎性程序性细胞死亡形式，已被证明是重塑肿瘤微环境和促进抗肿瘤免疫的有效策略。活性氧（ROS）可以激活Caspase-3/GSDME通路以诱导焦亡，从而实现对免疫激活的时空控制。在基于ROS的方法中，声动力疗法（SDT）具有显著优势，包括深部组织穿透性、非侵入性超声（US）激活以及高效的ROS生成。本研究开发了一种超薄二维Cu-TCPP纳米片（CuT），作为高性能声敏剂，在超声照射下能增强与氧气的相互作用和电子转移，从而放大ROS的生成。为了提高肿瘤内的递送和保留效果，CuT进一步被整合到基于丝纤维蛋白的微针（CuT-MN）中，实现局部、微创给药。该平台能够精确靶向肿瘤，持续富集声敏剂，并按需诱导焦亡，同时最小化脱靶毒性。总体而言，CuT-MN平台有效增强了抗肿瘤免疫反应，代表了精准声动力免疫疗法的一个有前景的方法。

引言

免疫疗法通过利用免疫系统选择性地消除恶性细胞，彻底改变了肿瘤治疗方式[1]，[2]。然而，其临床效果仍受到免疫抑制性肿瘤微环境的限制，这种微环境的特征是免疫浸润不足和抗原呈递受限[3]，[4]。为了克服这些挑战，人们付出了大量努力，试图将肿瘤微环境从免疫“冷”状态重新编程为激活的“热”状态，从而提高免疫疗法的效果[5]，[6]，[7]。焦亡作为一种促炎性的程序性细胞死亡形式，已成为抗肿瘤免疫激活的有希望的策略。与通常免疫沉默的凋亡不同，焦亡是由Caspase蛋白激活gasdermin（GSDM）家族成员介导的，导致跨膜孔的形成[8]。这一过程导致细胞肿胀、膜破裂，并释放促炎细胞因子和损伤相关分子模式（DAMPs），从而促进免疫细胞的浸润和激活[9]。这种炎症级联反应招募并激活免疫细胞，从而重塑免疫抑制性的肿瘤微环境，引发强烈的免疫反应。

活性氧（ROS）被认为是Caspase-3/GSDME介导的焦亡的强大诱导剂[10]，[11]，[12]。与其他诱导焦亡的策略（如化疗药物）相比，基于ROS的疗法通过外部能量源实现免疫反应的时空激活，使其在临床转化方面具有很大潜力[13]，[14]，[15]。在基于ROS的方法中，声动力疗法（SDT）相比光动力和化学动力疗法具有显著优势，包括更好的组织穿透性、非侵入性激活以及通过超声（US）实现精确的空间控制[16]，[17]，[18]，[19]。

金属有机框架（MOFs）[20]，[21]，[22]，[23]是一类由金属簇通过有机配体连接的结晶多孔材料，由于其可调的孔隙率、高表面积和多功能性，在生物医学应用中受到了广泛关注[24]。通过改变金属节点（例如Cu2?、Fe3?、Zn2?）和有机连接剂（例如羧酸盐、卟啉），可以设计出具有定制物理化学性质的MOFs，用于靶向药物递送、催化治疗和成像[25]，[26]。值得注意的是，MOFs作为声敏剂具有独特优势[27]，[28]。它们的多孔结构允许高效的氧气吸附和电子转移，这对于超声辐射下生成ROS至关重要。Cu-TCPP纳米片（CuT）是一种典型的MOFs，其中Cu2?与四羧基苯基卟啉（TCPP，一种卟啉衍生的声敏剂）的四个羧基团配位，形成交联框架[29]，[30]。这种配位结构不仅抑制了TCPP的聚集，还增强了电子转移和氧气激活，从而提高了ROS的生成效率。此外，将CuT制备成超薄二维纳米片显著增强了氧气吸附和电荷转移，在超声刺激下放大了单线态氧（1O?）的产生，从而实现了强烈的焦亡诱导[31]，[32]。这些结构和功能优势使CuT区别于传统的声敏剂，使其成为基于SDT的免疫疗法的一个非常有前景的平台[33]。

尽管CuT具有强大的生物活性，但肿瘤内递送效率低下仍然是治疗效果的主要瓶颈[34]，[35]，[36]。传统的给药途径，包括静脉注射（i.v.）和肿瘤内注射（i.t.），常常面临快速清除、肿瘤内保留差、脱靶积累和药物突然释放的问题，严重限制了原位ROS的生成[37]，[38]，[39]。因此，精确和持续地将CuT递送到肿瘤中对于释放其声动力潜力至关重要。

微针（MN）技术通过实现微创、肿瘤部位特异性给药，提供了强大的解决方案[40]，同时最小化了全身暴露[41]。与传统给药途径相比，MN能够实现治疗剂的精确沉积和在肿瘤微环境中的长时间保留[42]，[43]。丝纤维蛋白（以下简称丝）是一种生物相容性和可生物降解的天然聚合物，由于其机械强度和可调节的降解特性，是制造MN的理想基质[44]，[45]，[46]。基于丝的MN贴片已广泛用于药物递送、组织再生和疫苗给药[47]，[48]。此外，它们坚固的结构使得它们能够有效穿透皮肤，进一步增强了作为免疫疗法局部给药系统的有效性[49]，[50]。

在这项研究中，开发了一种负载有声敏剂CuT的丝基MN贴片（CuT-MN），以实现超声激活的焦亡诱导，从而实现强效的声动力免疫疗法。CuT被合成以在超声照射下高效生成ROS。为了进一步实现声动力免疫疗法的精确激活，CuT被整合到基于丝的MN中，促进了有效的局部、局部给药、深部肿瘤穿透和声敏剂的持续保留（图1A）。这确保了CuT在肿瘤部位的富集最大化。在超声照射下，CuT催化ROS的生成，激活Caspase-3/GSDME通路，从而诱导高效的焦亡（图1B）。重要的是，超声激活的焦亡对正常组织的损伤最小，提供了更精确和增强的免疫疗法。CuT-MN策略改善了肿瘤特异性药物保留，增强了免疫刺激，增强了SDT介导的焦亡，并减少了与传统肿瘤内（i.t.）和静脉注射（i.v.）给药相比的脱靶效应。值得注意的是，单次局部给药CuT-MN就能产生足够的原位ROS，以诱导强烈的焦亡，突显了其作为按需、非侵入性声动力免疫疗法平台的潜力。

超薄二维Cu-TCPP纳米片（CuT）的合成与表征

超薄二维Cu-TCPP纳米片（CuT）是通过改进的表面活性剂辅助方法合成的。简要来说，CuCl?·2H?O、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和三氟乙酸、TCPP在DMF和乙醇（1:1）中混合，并进行了水热反应。MOF晶体的各向异性生长受到PVP和三氟乙酸的控制，从而促进了超薄纳米片的形成（图1A）。原子力显微镜（AFM）的形态学表征显示

结论

本研究建立了一个协同治疗平台，将超声激活的焦亡与MN实现的局部递送相结合，以克服癌症免疫疗法中的关键障碍。通过将Cu-TCPP纳米片（CuT）设计为高效声敏剂，并将其嵌入到机械强度高的丝基MN中，该平台能够在肿瘤组织内实现治疗剂的精确、局部和持续富集。在超声刺激下，CuT产生高水平的ROS，触发

CRediT作者贡献声明

张明：撰写——原始草稿、可视化、验证、数据管理、概念化。李一凡：撰写——审阅与编辑、可视化、方法学、概念化。唐宏宇：验证、数据管理。李明轩：数据管理。沈美芳：可视化、验证、方法学、数据管理。Bing铁军：验证、方法学、研究。余英杰：撰写——审阅与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金获取

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

M. Z.和Y. L.对这项工作做出了同等贡献。这项工作得到了北京自然科学基金（JQ24055）、国家自然科学基金（12404501、52373127）以及CPSF博士后奖学金计划（GZC20230212）的支持。所有动物实验均按照中国北京生物技术有限公司（ZYZY202210011S）的机构动物护理和使用委员会的评估和批准进行。