《The Journal of Physiology》：Circular RNAs: Unlocking new avenues in cardiometabolic disease management
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这是一篇深入探讨环状RNA（circRNA）在心代谢疾病（CMD）中作用的前沿综述。文章系统阐述了circRNA的稳定特性和分子机制，揭示了其作为新型生物标志物和治疗靶点的巨大潜力，尤其是在心脏重塑和糖尿病心肌病等病理过程中。通过全面梳理其生成、功能、失调机制及递送策略，为开发circRNA相关诊疗工具提供了坚实的科学依据与未来方向。
Biogenesis and molecular characteristics of circRNAs
环状RNA（circRNA）主要是通过前体mRNA（pre-mRNA）的反向剪接产生的，即下游的5’剪接供体与上游的3’剪接受体连接，形成一个共价闭合的RNA环，与同一pre-mRNA的典型线性剪接竞争。其结构缺少自由的5’和3’末端，使其对核糖核酸酶（如RNase R）具有高度抗性，半衰期通常比其线性对应物更长，能在分化组织中积累至高稳态水平。circRNA通常根据其基因组起源进行分类：仅由外显子组成的外显子circRNA是记录中最主要的类型，通常富集于细胞质中，常充当微小RNA（miRNA）海绵和RNA结合蛋白支架；内含子circRNA主要定位于细胞核，可以增强其亲本基因的转录；外显子-内含子circRNA同时包含外显子和内含子序列，可与U1小核核糖核蛋白和RNA聚合酶II相互作用，并能顺式增加宿主基因的表达。此外，还有线粒体编码的circRNA和源自长链非编码RNA位点的circRNA等亚类。
Functional roles of circRNAs in the heart
circRNA在心脏中的功能作用主要与基因调控有关，包括转录和剪接的调控、miRNA海绵作用、蛋白质结合及其他功能，如细胞增殖。目前研究最深入的是其在心脏中的miRNA海绵作用。circRNA通过miRNA反应元件上的互补碱基配对来隔离miRNA，从而阻止miRNA与其靶向mRNA结合。在心脏组织中，circRNA对miRNA的这种海绵作用已被证明会影响细胞凋亡、心肌细胞生长、线粒体呼吸和心肌纤维化。circRNA在调节蛋白质稳定性、定位和功能方面的作用也已得到证实，例如通过防止蛋白质降解或促进核转位来实现。circRNA与RNA结合蛋白的相互作用可以调节转录机制成分如AGO2和RNA Pol II、剪接相关蛋白Mbl（与circ-Mbl竞争结合）、细胞周期调节因子如CDK2和p21（与circFoxo3形成三元复合物）等。鉴于这些机制是细胞基本过程的基础，它们很可能在心脏组织中发挥类似作用。
CircRNA dysregulation underlying adaptive and maladaptive cardiac remodelling
circRNA是心脏病理生理学的关键调节因子，在心脏重塑和心力衰竭中通过影响细胞死亡、肥大、纤维化等过程以及调节关键信号通路发挥关键作用。在心脏中，circRNA表达失调与多种心脏病变显著相关。首个被发现在心脏中具有功能作用的circRNA是心脏相关circRNA（HRCR），在衰竭的小鼠心脏中其基因表达显著降低。从机制上讲，HRCR作为miR-223的海绵，通过抑制ARC（具有CARD结构域的凋亡抑制因子）蛋白来调节心脏肥大和心力衰竭。心脏肥大相关circRNA（circRNA CHRC）是心力衰竭进展的关键调节因子，部分通过其竞争性内源RNA功能，与miR-431-5p/Kruppel样因子15轴相互作用，该轴对心脏肥大和纤维化至关重要。证据表明，心肌细胞内circRNA海绵作用的调节可以影响心肌梗死的结果。在小鼠心脏中抑制circNCX1已被证明可以通过海绵吸附miR-133a-3p来减轻心脏缺血-再灌注损伤，否则该miR会促进心肌细胞凋亡。在扩张型心肌病中，RYR2基因表达的改变导致circRYR2_71和circRYR2_95下调，从而引起氨基酸序列改变和蛋白质结构与功能破坏。在心脏衰老环境中，circ-Foxo3通过与衰老相关蛋白形成复合物来促进细胞衰老过程。在肥厚型心肌病患者中，circZFPM2的表达上调，但出乎意料的是，体外沉默circZFPM2会诱导心肌细胞肥大并损害线粒体呼吸功能，导致活性氧生成增加和细胞凋亡增多，而进一步过表达则能在人心脏类器官中挽救心肌细胞功能，表明circZFPM2在肥厚型心肌病中的激活是代偿性和保护性的。
在运动诱导的心脏生长环境中，游泳训练的成年小鼠心肌细胞和长期运动后的运动员血清中发现circUtrn表达上调。体内抑制circUtrn会抑制心脏肥大的发展并降低游泳训练后小鼠增殖标志物的表达水平，表明circUtrn是运动诱导心脏组织生理性肥大生长所必需的。通过在小鼠缺血/再灌注模型中过表达circUtrn，证明了其保护作用，包括改善心脏功能和减轻心脏纤维化。circUtrn通过丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP5促进心肌细胞生长和存活的机制是，circUtrn直接与心肌细胞中的PP5结合，通过泛素-蛋白酶体依赖机制调节PP5蛋白稳定性，从而影响下游信号传导，如丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）通路。
Therapeutic potential of circRNAs in diabetic cardiomyopathy
最近的研究报告了circRNA在糖尿病心肌病多个方面中的作用。通过遗传操作心脏表达的circRNA，已证明多个靶点具有治疗潜力。例如，通过使用腺相关病毒血清型9（AAV9）递送shRNA来敲低链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠心脏中的circHIPK3，证明了circHIPK3的治疗靶向潜力，成功挽救了糖尿病小鼠的心脏纤维化、心肌重塑和收缩功能障碍。多项研究表明circRNA参与糖尿病中的心肌细胞死亡。体外机制实验已阐明circMAP3K5在介导高糖诱导的心肌细胞死亡中的分子信号通路：CircMAP3K5靶向miR-22-3p，从而解除其对死亡相关蛋白激酶2（DAPK2）的抑制作用。通过siRNA敲低circMAP3K5可完全减轻高糖诱导的促凋亡标志物Bax/Bcl2比率和cleaved caspase-3的增加。另一个circRNA，CDR1as，同样被证明可调节糖尿病中的心肌细胞死亡。CDR1as在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠心脏中上调，siRNA敲低CDR1as可通过Hippo信号通路减轻体外高糖诱导的心肌细胞死亡。体内实验中，AAV9递送靶向CDR1as的shRNA实现了心肌中CDR1as的敲低，并挽救了糖尿病小鼠的收缩功能障碍。使用功能获得性和功能丧失性DICAR基因小鼠模型，已证明circRNA DICAR在介导糖尿病心肌病细胞焦亡（一种高度炎症性的程序性细胞死亡）中的作用。此外，合成的DICAR片段在体外被证明可以减轻心肌细胞焦亡。新兴证据表明circRNA也参与PANoptosis（一种涉及称为panoptosomes的多组分复合物的程序性细胞死亡）。通过AAV9-siRNA递送下调circOGDH减轻了PANoptosis，并部分恢复了糖尿病小鼠的心脏功能。相反，通过慢病毒递送上调circOGDH则加剧了糖尿病心肌病。体内功能获得性和功能丧失性AAV9实验同样证明了circ_0005007在糖尿病小鼠心肌纤维化、心脏肥大、铁死亡和心功能障碍中的参与。
Delivery strategies for circRNA therapeutics
环状RNA最常用的递送平台包括细胞外囊泡（EV）、脂质纳米粒（LNP）和AAV载体，每种平台在稳定性、靶向性和翻译效率方面为心脏基因和RNA递送提供独特优势。EV是天然衍生的载体，将circRNA包裹在脂质双层内，具有高生物相容性、低免疫原性以及内在的或经过工程改造的组织趋向性潜力。在临床前研究中，EV介导的circWhsc1递送在心肌梗死后诱导了心肌细胞增殖和心脏再生。LNP是合成递送系统，能有效保护circRNA免于降解并促进细胞摄取，在可扩展性、制造控制和短暂的、非整合性表达方面具有优势。然而，全身给药的LNP主要积聚在肝脏，这降低了对心脏的有效递送，并导致更大的脱靶转录组效应和免疫激活。近期circRNA纯化和LNP递送策略的优化，包括新型可离子化脂质和冻干方法的开发，提高了稳定性并在体内表达，推进了circRNA治疗的实际应用。
AAV载体具有已知的体内转导效率，特别是通过AAV9等心脏趋向性血清型，能够在心脏病动物模型中实现持久的基因表达和强大的功能益处。然而，AAV面临重大挑战，包括预先存在的中和抗体、剂量依赖性毒性以及严格的约4.7 kb包装限制，这限制了治疗性有效载荷的大小。这些平台在安全性、表达持久性、有效载荷容量和转化可扩展性方面呈现出互补的权衡取舍，强调了根据治疗背景选择平台的重要性。
CircRNAs as biomarkers in cardiometabolic diseases
环状RNA具有几个使其成为有希望的疾病生物标志物候选者的特征。circRNA在循环中含量丰富，并且由于其闭合的环状结构提供了对核酸外切酶降解的抗性，因此具有强大的稳定性特征。circRNA参与心脏疾病机制的证据（如上详述）加强了其作为疾病生物学指标的论据。迄今为止，对circRNA作为心血管疾病生物标志物的研究主要集中在缺血性环境下（心肌梗死、缺血性心脏病、冠状动脉疾病）检测心肌损伤。调查circRNA作为心力衰竭生物标志物的研究更为有限。
在现有的少数报告中，一些circRNA已成为潜在的心力衰竭生物标志物，尽管样本量小，需要进一步验证。在一项来自3名慢性心力衰竭患者的血浆微阵列筛选中，与3名健康对照相比，鉴定出477个circRNA上调，219个circRNA下调。在30名心力衰竭患者队列中，进一步研究了5个主要上调的circRNA候选物，并验证了两种circRNA（hsa_circ_0062960和hsa_circ_0112085）作为心力衰竭生物标志物的临床效用。报告显示血清B型利钠肽（BNP）与circRNA hsa_circ_0062960存在显著相关性。在另一项对5名心力衰竭患者血液样本的类似研究中，鉴定出29个上调和27个下调的circRNA。在40名心力衰竭患者队列中使用定量PCR（qPCR）进一步分析的6个circRNA中，hsa_circ_0097435被确定为上调程度最大的主要候选物。
Challenges and future directions
circRNA研究的一个持续障碍是缺乏跨数据库和研究的统一命名规则，这使得荟萃分析和重复实验变得复杂。最近的提案主张采用通用的、与基因关联的命名方案。此外，当使用基于反向剪接连接点（BSJ）的方法时，来自同一线性RNA分子的不同circRNA可能无法区分。长读长RNA测序通过捕获内部序列、改善亚型注释和低丰度下的灵敏度提供了帮助。然而，当前的长读长平台在通量和读长之间需要权衡，并且可能显示出更高的错误率，因此建议将长读长和短读长数据与正交验证（RT-PCR、Northern印迹、RNase R处理）相结合。
干预研究表明，过表达和敲低都可以在体内改变各种疾病特征。病毒载体（腺病毒、慢病毒和AAV）、细胞外囊泡和纳米颗粒是circRNA的递送途径。尽管circRNA具有稳定性，但其治疗应用在递送、生物分布、持久性和安全性方面仍面临障碍。这些问题包括：（i）使用临床可扩展的载体进行靶向递送，同时最大限度地减少非靶组织暴露；（ii）先天免疫反应；（iii）生产和质量控制（避免缺口/多联体物种）；（iv）剂量控制；（v）有别于线性RNA药物的明确监管指南。临床前肿瘤学和传染病模型显示了可行性，但在更广泛地独立用于心代谢疾病之前，需要在安全性和药理学方面进行严谨研究。尽管circRNA疗法目前更可能作为辅助剂，与当前标准疗法互补，并在未来推进心代谢疾病的治疗。最近的证据表明，一些现有药物的作用机制与circRNA调节存在内在联系。例如，他汀类药物通过上调circRNA-RBCK1改善心脏内皮功能，而钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂通过涉及其他circRNA（主要通过miRNA海绵作用）的途径发挥保护作用。利用这些相互作用可以提高疗效，减少现有药物的所需剂量，并减轻脱靶副作用，最终改善患有复杂心代谢疾病患者的临床结果。要实现这一潜力，需要克服免疫原性、脱靶效应和递送问题，并在人体中进行试验。
