《MicrobiologyOpen》：Cassava Endophytic Bacteriome as Potential Biocontrol Agents Against Three Crop Phytopathogenic Fungi
1 引言
植物病原体和害虫导致全球主要作物产量损失高达40%，造成数千亿美元的生产损失。由真菌病原体引起的疾病约占这些损失的20%?40%，每年在木薯、高粱和马铃薯等主要作物上造成1000-2000亿美元的损失。造成巨大产量损失的作物真菌病原体包括炭疽菌属(Collectorichum spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)和疫霉属(Phytophthora spp.)。炭疽菌属是影响非洲多种重要粮食和经济作物的最显著真菌病原体之一。最具破坏性的木薯真菌病害之一——木薯炭疽病(CAD)，是由多种炭疽菌引起的。该病导致严重感染茎秆的发芽率仅为40%?60%，而受感染的种子材料会导致50%?75%的种子活力丧失。其他重要的作物真菌病原体还包括引起高粱炭疽病的Collectorichum sublineola和引起马铃薯晚疫病的Phytophthora infestans。由P. infestans引起的马铃薯晚疫病是全球最具破坏性的病害，也是影响马铃薯生产的关键生物因子，每年造成约100亿美元的作物损失。
多年来，化学方法一直被用于控制真菌病原体，然而它们的使用带来了沉重的经济成本和环境污染。随着这些化学策略效果减弱且产生不良影响，需要更生态可持续的病原体控制措施。因此，利用拮抗性内生细菌等绿色安全的生物防治方法越来越受到科学界的关注。内生细菌作为生物防治剂(BCAs)引起了人们的兴趣，因为它们不仅能抑制病原体生长并诱导植物抗病性，而且符合公众对食品安全和环境友好的需求。
内生细菌作为BCAs具有巨大的未开发潜力，因为它们能够定殖在与植物病原体相同的生态位中。其中，芽孢杆菌属(Bacillus)物种通常被用作管理多种植物病害的生物防治剂储备库。它们通过产生广谱抗菌化合物（如细胞外脂肽、裂解酶、聚酮化合物和挥发性有机化合物(VOC)）、诱导植物系统抗性、抑制病原体入侵、干扰病原体群体感应(QS)以及与病原体竞争营养和/或生态位，展现出强大的拮抗潜力。从木薯中分离的内生细菌Bacillus siamensis、B. velezensis和B. subtilis已被报道为植物病原体控制剂。Bacillus velezensis是一种潜在的植物病害生物防治剂，广泛存在于自然界中，包括植物组织内，其特点是能够适应多样的环境条件。最近的研究已将内生细菌B. velezensis定位为生物防治应用的有前途候选者，因为它对真菌植物病原体具有拮抗活性。该内生细菌合成抗菌化合物，如水解酶、细菌素、脂肽（例如，伊枯草菌素A、 surfactin）、VOCs和聚酮化合物，可以抑制植物病原体。
Bacillus subtilis尤其引人注目，因为它具有多种作用模式和环境兼容性。它部署了一系列拮抗机制，包括产生抗真菌环状脂肽，如丰原素、surfactin和伊枯草菌素A，这些对广泛的作物病原体有效。此外，B. subtilis分泌多种酶，如蛋白酶、β?1,3-葡聚糖酶和纤维素酶，能降解真菌细胞壁，并产生铁载体以螯合铁，这是真菌生长的关键矿物质营养。Bacillus subitlis还被报道能诱导植物系统抗性作为一种间接抗菌效应，触发其防御机制并增强对病原体攻击的抵抗力。Bacillus siamensis也成为了一种有前景的生物防治剂，因为它能够通过抗生作用和竞争排斥促进植物生长和抗性。
本研究的新颖之处在于详细研究了木薯内生细菌对C. siamense、C. sublineola和P. infestans的抗真菌保护作用，这是一个尚未被广泛探索的领域。关于木薯内生细菌及其对三种作物真菌植物病原体的生物防治潜力的信息有限。本研究填补了文献中的一个关键空白，特别是关于木薯内生芽孢杆菌物种控制分别感染木薯、高粱和马铃薯的C. siamense、C. sublineola和P. infestans的潜力。
2 材料与方法
2.1 样品采集
健康的叶、茎和叶柄样品采集自内罗毕大学Kabete试验站实验田种植的8个月大的四个木薯品种植株。所选品种对感染木薯的炭疽病和叶斑病具有抗性。
2.2 木薯内生细菌的分离
内生细菌的分离按照Costa等人的方法进行修改。叶、茎和叶柄样品用流水冲洗2分钟以去除表面碎屑，然后用70%乙醇表面灭菌1分钟，再用2%次氯酸钠溶液消毒1分钟。然后将样品用无菌蒸馏水冲洗三次并用无菌滤纸吸干。为了评估灭菌过程的有效性，将最后一次冲洗水的1 mL铺在营养琼脂(NA)培养基上。将植物样品切成大约5×5 mm的小块，铺在营养琼脂培养基上，然后在28°C下孵育2-3天。选择由此产生的形态不同的内生细菌菌落，在NA培养基平板上传代培养以获得纯菌落，然后转移到营养肉汤(NB)培养基中。
2.3 内生细菌抗真菌活性的体外初步筛选
使用Sharma等人描述的双重培养法筛选内生细菌分离株抑制木薯病原真菌Colletotrichum siamense生长的能力。对于双重培养测定，将来自7天龄真菌培养物的6 mm直径菌块接种在PDA平板中心，同时将20 μL纯内生细菌悬浮液以圆形图案接种在距平板边缘1 cm的真菌菌块周围。对所有分离的内生细菌单独进行此操作，每个平板接种一种纯细菌分离株。仅接种真菌菌块的PDA平板用作实验对照。平板在28°C下孵育7天。记录对照平板和处理平板中真菌分离株的直径测量值。选择显示抑制真菌生长的内生细菌分离株，并用三个生物学重复重复双重培养测定。使用Sharma等人描述的公式计算Colletotrichum siamense的生长抑制百分比。
2.4 拮抗性细菌内生菌的分子鉴定和系统发育分析
通过16S rRNA测序鉴定筛选出的拮抗性细菌内生菌。首先使用PureLink基因组DNA小提试剂盒提取拮抗性细菌内生菌的基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA质量。
使用细菌16S rDNA引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA样品。PCR扩增在总体积25 μL中进行。使用的PCR循环条件是：95°C初始变性5分钟，随后进行35个循环，最后在72°C下延伸7分钟。使用1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。将PCR产物送往荷兰Macrogen公司进行Sanger测序。
将获得的序列图谱转移到BioEdit序列比对编辑器程序中，进行可视化和手动编辑以获得重叠序列。然后将重叠序列进行BLAST搜索，用于分类学鉴定和选择用于系统发育分析的序列。使用贝叶斯系统发育方法进行基于核苷酸序列的系统发育分析。使用Figtree软件可视化树。
2.5 筛选内生细菌对三种作物真菌病原体的抗真菌活性
基于双重培养测定（直接）、无细胞上清液（间接）和VOCs（远程对抗），筛选对C. siamense具有拮抗活性的所选内生细菌对C. sublineola和Phytophthora infestans的拮抗活性。
2.5.1 双重培养平板测定（直接对抗）
如Sharma等人所述进行双重培养平板测定并进行修改。测试基于对C. siamense的拮抗筛选选择的内生细菌抑制分别感染高粱和马铃薯的Colletotrichum sublineola和Phytophthora infestans生长的能力。
2.5.2 基于细菌挥发性有机化合物的内生细菌抗真菌活性（远程对抗）
使用先前描述的倒置培养皿微观系统设置来确定细菌挥发性有机化合物(VOCs)的抗真菌活性。将200 μL细菌悬浮液接种在营养琼脂平板上，并使用无菌棉接种拭子均匀涂布。通过将6 mm的7天龄真菌菌块接种在PDA平板中心来制备病原真菌。移除内生细菌平板和真菌平板的盖子，将接种病原真菌分离株的隔室倒置放在涂有内生细菌的隔室上，然后用石蜡膜紧密密封。对照平板设置用无菌营养肉汤代替细菌接种。对所有三种真菌样品和所选细菌分离株进行此操作。将微观系统设置在25°C下孵育7天，之后测量真菌直径。细菌VOCs的抗真菌功效计算如下。
2.5.3 基于无细胞上清液(CFS)的内生细菌抗真菌活性（间接对抗）
根据Liu等人的方法制备CFS并进行轻微修改。将内生细菌在营养肉汤中于28°C培养72小时，然后以8000 rpm离心20分钟。收集上清液并通过0.20 μm膜过滤器过滤以获得无菌管中的CFS。
对于每种内生细菌，将2 mL CFS溶液倒入每个无菌培养皿中，然后加入20 mL在40°C的PDA。对于对照平板，使用接种2 mL无菌营养肉汤的PDA平板。将每种真菌分离株的6 mm菌块接种在每个平板的中心，并在25°C下孵育7天。测量病原真菌的直径，并使用Sharma等人描述的公式计算细菌CFS的抗真菌功效。
2.6 细菌挥发性化合物的气相色谱-质谱(GC-MS)分析
选择内生细菌分离株AS3进行GC-MS分析以鉴定细菌挥发性化合物。在进行GC-MS分析之前，将分离株AS3在营养肉汤中于28°C培养24小时。将样品分别用10 mL己烷、乙酸乙酯、石油醚、苯、丁醇和甲醇进行分配。合并溶剂层并使用高纯度氮气浓缩至1 mL体积。将20 μL样品进行GC-MS分析。
使用配备DB5毛细管柱的Agilent 7890 A气相色谱仪与Agilent 5975 C质谱仪联用进行GC-MS分析。将色谱柱温度从50°C程序升温至120°C，速率为15°C/分钟，最终温度达到250°C，升温速率为10°C/分钟。使用氦气作为载气，流速为1 mL/分钟。通过将获得的质量谱与NIST谱库中的可用数据进行比较来鉴定挥发性组分。每种化合物的含量表示为总离子色谱图中峰面积的相对面积。
2.7 温度、金属离子、盐和渗透胁迫对内生细菌的影响
按照Slama等人描述的方法测定所选内生细菌在不同浓度的盐和金属离子、渗透胁迫(PEG)和温度下的生长能力。为此，将内生细菌在不同盐浓度的营养肉汤中生长以确定其对盐度的耐受性，在不同浓度的聚乙二醇(PEG)中生长以确定其对渗透胁迫的耐受性，以及在CuSO4中生长以确定在金属(Cu2+)离子存在下的生长。样品在28°C下孵育48小时，之后通过使用分光光度计在600 nm处测量吸光度来确定细菌生长。通过将细菌接种在NA培养基上并在相应温度下孵育48小时来确定细菌分离株在不同温度条件下的生长能力。
2.8 内生细菌对木薯生长的体内影响
根据Ferreira等人的方法，在温室条件下测定内生细菌对木薯植物生长的影响并进行修改。
将木薯茎插条种植在装有200克森林土壤的塑料盆中。让发芽的植物在温室条件下生长2周，然后用于接种实验。
在接种到木薯植物中之前，将内生细菌在营养肉汤中于28°C培养24小时。然后将培养的细菌以6000 rpm离心15分钟并弃去上清液。将细菌沉淀细胞悬浮在盐溶液中，然后使用分光光度计在600 nm处测量吸光度。使用盐溶液将吸光度测量值调整为OD 0.5，得到用于接种木薯植物的细菌悬浮液。
将制备好的内生细菌悬浮液接种到温室中的2周龄木薯植物中。对于每种处理，用2 mL细菌悬浮液滴接种五株植物，并在14天后重复接种。五株对照植物滴加2 mL无菌盐溶液，并在14天后重复此操作。每株植物2 mL的细菌悬浮液是用于完全均匀灌溉每个塑料盆中200克土壤所需的体积。将接种和对照植物在温室条件下培养14天以进行进一步分析。所有植物每2天浇水一次。测量并记录接种后30天木薯植物的植物生长相关参数。
2.9 统计数据分析
使用InfoStat v2008中相应的R包，通过广义线性模型对抑制百分比进行方差分析(ANOVA)。检查正态性和同方差性并在必要时进行校正，并使用Fisher最小显著性差异检验分离平均值。使用GraphPad Prism v.5.03绘制数据。
3 结果
3.1 从木薯中分离内生细菌及对C. siamense的拮抗活性初步筛选
从四个木薯品种的叶、茎和叶柄组织中分离出84种细菌内生菌，并针对C. siamense的生长进行了体外测试。十四种内生细菌分离株不同程度地抑制了C. siamense的生长。与对照相比，C. siamense在内生细菌分离株存在下的直径范围为22±0.08至35±0.08 mm。对照平板（不含内生细菌的C. siamense）的直径显著更高。
3.2 使用16S rRNA对拮抗性内生细菌进行分子鉴定
使用核糖体区域16S rRNA鉴定了14种拮抗性细菌分离株。对12种内生细菌分离株的序列分析显示与芽孢杆菌属有97%–100%的匹配，它们被指定为B. siamensis、B. velezensis、B. subtilis、B. safensis、B. cereus、B. stratosphericus和B. altudinis。对两种内生细菌分离株的序列分析显示与Staphylococcus saprophyticus有99%和100%的匹配。
系统发育树构建显示当前研究的内生细菌分离株与NCBI数据库中已知序列有密切关系。系统发育分析表明，分离株AS3与登录号为ON908919.1的B. siamensis关系最密切，而分离株CS3b和DP1与登录号为MN559570.1的B. velezensis关系密切。分离株DL6与登录号为KY072760.1的B. subtilis关系密切。分离株CP3和AL3与登录号为PP390036.1的Staphylococcus saprophyticus形成一个分支。该分支内还有S. pseudoxylosus和S. xylosus的菌株。
3.3 P. infestans、C. siamense和C. sublineola的体外生长抑制
从对C. siamense的初步拮抗筛选中鉴定出的14种内生细菌在双重培养测定中也表现出对其它真菌病原体P. infestans和C. sublineola生长的抑制特性。内生细菌的生长抑制范围对于C. siamense为23.3%?72.3%，对于C. sublineola为27.7%?66.8%，对于P. infestans为24.3%?75.3%，且内生细菌之间存在显著差异。
选择四种内生细菌分离株，即B. siamensis AS3、B. velezensis DP1、B. velezensis CS3b和B. subtilis DL6用于后续实验，它们对所有三种真菌病原体的生长抑制均高于60%。Bacillus siamensis AS3对病原体P. infestans和C. sublineola的生长抑制最高，而B. velezensis CS3b对C. siamense生长的拮抗作用最高。这四种内生细菌分离株在抑制P. infestans、C. siamense和C. sublineola的菌丝生长方面没有统计学上的显著差异。
3.4 所选内生细菌VOCs对P. infestans、C. siamense和C. sublineola的抗真菌活性
测试了四种潜在内生细菌分离株通过产生挥发性有机化合物对真菌菌丝生长的拮抗活性。所有选定的内生细菌分离株都产生了抑制真菌病原体菌丝生长的VOCs，但拮抗水平不同。Phytophthora infestans在孵育10天后受到显著抑制。在C. siamense中，B. siamensis AS3的抑制率最高，而B. velezensis CS3b的抑制率最低。分离株B. subtilis DL6对C. sublineola生长的抑制作用最高，而B. velezensis CS3b的作用最小。四种细菌内生菌对真菌病原体C. siamense和C. sublineola的生长抑制没有显著差异，而对于P. infestans的生长则观察到显著差异。
3.5 无细胞上清液（琼脂可扩散代谢物）对P. infestans、C. siamense和C. sublineola的影响
来自所选四种内生细菌分离株的无细胞上清液抑制了三种真菌病原体的菌丝生长。来自分离株B. subtilis DL6的CFS对P. infestans生长的抑制作用最高，而来自分离株B. velezensis DP1的抑制作用最低。对于C. siamense，来自B. siamensis AS3的CFS显示出最高的菌丝生长抑制，而B. subtilis DL6的记录最低。来自B. siamensis AS3的CFS对C. sublineola的菌丝生长抑制最高，而B. velezensis DP1的记录抑制最低。在C. siamense和C. sublineola的情况下，四种内生细菌的CFS对菌丝生长的抑制存在显著差异。四种内生细菌的CFS对P. infestans的菌丝生长抑制没有显著差异。
3.6 使用GC-MS分析鉴定内生细菌VOCs
选择对P. infestans、C. siamense和C. sublineola具有最高抗真菌活性的内生细菌分离株进行GC-MS分析。GS-MS分析揭示了B. siamensis AS3分离株产生的挥发性化合物的存在。基于GC-MS分析检测到总共20种挥发性化合物，其中13种化合物被报道具有抗真菌特性。B. siamensis AS3产生的化合物十三烷胺、邻二甲苯、十六烷、丁基苯和2,3,5-三甲基己烷的百分比丰度分别为14.64%、13.03%、12.76%、12.5%和11.02%。其他化合物的丰度较低，范围从0.33%到10.15%。
3.7 内生细菌的生理学表征
测试了所有四种潜在内生细菌分离株的耐盐性，它们都能够在0%?6% NaCl中保持生长。然而，随着盐浓度的增加，生长速率下降，生长存在显著差异。细菌分离株还表现出对渗透胁迫的耐受性，能够在含有高达10%的渗透胁迫诱导剂聚乙二醇(PEG)的培养基中生长。随着PEG浓度的增加，所有四种内生细菌的生长均显著减少。所有分离株在10°C?50°C的温度范围内都表现出生长能力。在30°C的温度下观察到最佳生长，在较高和较低的温度下生长减少。内生细菌分离株通过在高达200 mg L?1的CuSO4中生长，表现出在金属离子存在下的生长能力，除了分离株B. velezensis CS3b只能耐受高达150 mg L?1的生长。
3.8 所选内生细菌的植物生长促进活性
在接种内生细菌的植物中观察到的生长参数显著高于未接种的对照植物。由于内生细菌接种，木薯植物的高度与未接种植物相比显著增加。与未接种植物相比，生长性能（包括整株植物的鲜重和干重、叶数、根长和根数）存在显著差异。
4 讨论
本研究探讨了从四个木薯品种的叶、茎和叶柄中分离的内生细菌对感染木薯、高粱和马铃薯的真菌病害的生物防治潜力以及促进木薯生长的能力。在本研究中，获得了84种木薯植物内生细菌分离株，以确定它们对感染马铃薯、木薯和高粱的P. infestans、C. siamense和C. sublineola的拮抗潜力。初步筛选证实了14种内生细菌分离株与对照相比对真菌病原体C. siamense的拮抗潜力。使用16S rRNA的核糖体区域，确认12种和2种内生细菌分离株分别属于芽孢杆菌属和葡萄球菌属。本研究发现14种内生细菌分离株对病原体P. infestans、C. siamense和C. sublineola具有潜在的生物防治活性，对应为Bacillus siamensis、B. velezensis、B. subtilis、B. cereus、B. safensis、B. aerophilus、B. altitudinus和Staphylococcus saprophyticus。
所选分离株B. velezensis DP1和CS3b、B. siamensis AS3和B. subtilis DL6在直接对抗病原体以及通过使用其挥发性有机化合物和琼脂可扩散代谢物间接对抗时表现出最高的抗真菌效果。所选内生细菌对三种真菌病原体Colletotrichum siamense、C. sublineola和P. infestans的抑制水平超过60%。内生细菌和真菌病原体之间没有物理接触的清晰抑制区可能是由于这些内生细菌产生抑制真菌菌丝生长的活性抗真菌物质。细菌内生菌也可能与病原体竞争营养，从而抑制真菌菌丝生长。
还研究了所选内生细菌分离株产生的VOCs对P. infestans、C. siamense和C. sublineola菌丝生长的影响，以阐明其他潜在的抑制机制。内生细菌B. velezensis DP1和CS3b、B. siamensis AS3和B. subtilis DL6产生的VOCs抑制了三种植物病原真菌的菌丝生长。来自微生物群落的挥发性有机化合物参与物种通讯，并因其抗真菌和抗生素特性而被广泛研究。来自内生菌的VOCs通过充当抗菌剂和诱导植物病原体抗性来帮助疾病控制，从而防止病原体定殖。内生细菌B. velezensis DP1和CS3b、B. siamensis AS3和B. subtilis DL6产生的VOCs显著抑制了三种植物病原真菌的生长。然而，与在体外双重培养测定中使用活细菌细胞相比，VOCs的抗真菌功效显著较低。这是由于在双重培养测定中细菌细胞释放的抗真菌化合物与VOCs的协同效应。
内生细菌的无细胞上清液对三种真菌病原体的生长显示出抑制作用。来自内生细菌B. velezensis DP1和CS3b、B. siamensis AS3和B. subtilis DL6的CFS显著抑制了三种真菌病原体C. siamense、C. sublineola和P. infestans的生长。芽孢杆菌物种分泌多种次生代谢物，对植物病原体具有高度抑制性。这可以解释本研究中真菌病原体生长的抑制效果。本研究因此支持了先前关于细菌CFS在真菌病原体生物防治中作用的研究。本研究支持了先前关于芽孢杆菌物种产生不同次生代谢物和拮抗物质的报道。关于木薯内生细菌在各种测定中对三种作物真菌病原体的拮抗活性的发现表明，它们在其它作物中真菌病原体的广谱生物防治中具有潜力。
细菌内生菌是可用于控制植物病害的生物活性化合物的可靠来源。在我们的研究中，使用GC-MS检测了最有效的拮抗性内生细菌B. siamensis AS3提取物中的挥发性生物活性抗真菌化合物。从GC-MS分析中，发现B. siamensis AS3产生20种VOCs，其中12种被报道具有已知的抗真菌特性。这些生物活性化合物在内生细菌B. siamensis AS3的无细胞提取物中显示出大的峰，表明它们对抗真菌活性有显著贡献。发现烷烃和苯衍生物在内生细菌B. siamensis AS3的底物中具有所有挥发性次生代谢物的最大峰。这证实了先前的报道，即这些化合物负责广泛的抗真菌活性。
测试了拮抗性内生细菌B. velezensis DP1、B. velezensis CS3b、B. siamensis AS3和B. subtilis DL6的非生物胁迫耐受性，包括盐度、干旱胁迫、温度和铜离子。拮抗性内生细菌能够在6% NaCl、10% PEG和高达50°C的温度下生长。这一特征使这些内生细菌成为可以在盐碱地区利用以提高农业生产力的潜在理想候选者。关于耐热性的发现表明，这四种拮抗性内生细菌可能是简单/中度嗜热菌，因为它们能够在高达50°C的热胁迫条件下生长。铜杀菌剂经常用于植物真菌病原体的化学防治。内生细菌，特别是B. siamensis AS3和B. subtilis DL6，在高铜离子浓度的环境中生存的能力表明它们有可能在曾使用这些杀菌剂的土壤中使用。这四种拮抗性内生细菌对盐度、温度和干旱变化以及铜毒性的适应性使它们适合作为适用于广泛生态系统的生物防治剂候选者。
测试了四种拮抗性内生细菌B. velezensis DP1、B. velezensis CS3b、B. siamensis AS3和B. subtilis DL6对木薯幼苗植物的植物生长促进活性。接种的木薯植物显示出比未接种的对照植物更好的生长。与未接种植物相比，接种植物的生长参数显著改善。这些研究表明，接种细菌内生菌后植物生长的改善可能是由于接种细菌的植物生长促进潜力。同样，在本研究中，接种木
