《Molecular Plant Pathology》：The Tomato Transcription Factor RAV Affects the Systemic Infection of TYLCV by Interacting With V2
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本研究揭示了番茄转录因子SlRAV2通过与番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）编码的RNA沉默抑制因子V2蛋白互作，在调控病毒系统感染中的双重角色：SlRAV2一方面被V2招募以增强其与双链小干扰RNA的结合能力，从而短暂促进病毒局部积累；另一方面，SlRAV2利用此互作增强其对防御基因SlPR1启动子的结合与激活，触发活性氧积累和局部细胞坏死，有效抑制了病毒向系统叶片的扩散。这一发现为理解植物-病毒互作的复杂网络及开发抗病毒策略提供了新视角。
1 引言
番茄（Solanum lycopersicum）是世界范围内重要的经济作物，但常受到病毒病害的严重威胁，其中番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）是造成番茄黄化曲叶病的主要病原，可导致产量和品质的巨大损失。TYLCV属于菜豆金黄花叶病毒属（Begomovirus），通过烟粉虱（Bemisia tabaci）以持久循环方式高效传播，其基因组编码多个蛋白，其中V2蛋白被鉴定为一种RNA沉默抑制因子（RSS），能够通过结合双链小干扰RNA（ds siRNA）等方式，干扰宿主的转录和转录后基因沉默，从而抑制植物的抗病毒RNA干扰（RNAi）机制。
植物拥有一套复杂的防御系统来对抗病原体入侵。转录因子（TFs）在调控防御基因表达中起着核心作用。APETALA2/乙烯响应因子（AP2/ERF）超家族是一个庞大的植物特异性转录因子家族，其中RAV（RELATED TO ABSCISIC ACID INSENSITIVE3/VIVIPAROUS2）亚家族成员包含AP2和B3两个DNA结合域。越来越多的证据表明，RAV转录因子参与了植物对多种生物胁迫的响应，尤其是在水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）介导的防御反应中发挥作用。例如，葡萄中的VvRAV1可与病毒蛋白互作调控防御基因VvPR1的表达，而梨中的PbRAV1通过互作增强了对苹果茎沟病毒的抵抗。然而，番茄中RAV家族成员在抗病毒，特别是抗TYLCV感染中的具体功能和分子机制尚不清楚。
本研究基于前期发现TYLCV感染后番茄中一个RAV基因（SlRAV2）表达显著上调，深入探究了SlRAV2在TYLCV感染中的作用。通过酵母双杂交筛选，发现SlRAV2与TYLCV的V2蛋白存在直接相互作用，并围绕这一互作展开了一系列分子和功能分析。
2 结果
2.1 番茄转录因子SlRAV2与TYLCV V2互作
以TYLCV V2蛋白为诱饵进行酵母双杂交筛选，从一个番茄cDNA文库中鉴定出一个与SlRAV2 C端区域相互作用的克隆。进一步的实验证实了SlRAV2全长与V2在酵母中的互作，并且这种互作依赖于SlRAV2的C端区域（包含B3结构域），而其N端区域（包含AP2结构域）则不参与互作。这一结果在体外下拉实验和植物体内的双分子荧光互补实验中得到了验证。
C互作产生的荧光信号，定位于细胞核。">
2.2 SlRAV2对TYLCV感染的影响
通过瞬时沉默和过表达SlRAV2基因，研究其对TYLCV积累的影响。结果表明，沉默SlRAV2会导致接种早期（2天）局部叶片中病毒积累减少，但到了后期（4天和10天），局部和系统叶片中的病毒积累均高于对照。相反，过表达SlRAV2则导致接种早期（2天）局部病毒积累短暂升高，随后（4天）下降，并且在接种后10天，系统叶片中的病毒积累显著低于对照。组织化学染色（台盼蓝和DAB染色）显示，过表达SlRAV2减轻了系统叶片的坏死和活性氧积累，而沉默则加剧了这些症状。这些结果表明，SlRAV2通过促进局部叶片在感染早期的反应，限制了病毒向系统叶片的扩散。
SlRAV2增加番茄系统叶片TYLCV积累。C) 过表达SlRAV2减少番茄系统叶片TYLCV积累。B, D) 相应的DAB和台盼蓝染色结果显示SlRAV2表达水平影响叶片坏死和活性氧积累程度。">
2.3 SlRAV2增强V2抑制RNA沉默的能力
V2作为RSS，能抑制GFP报告基因的沉默。共表达实验发现，当SlRAV2或其C端与V2共表达时，GFP的荧光强度和蛋白积累水平均显著高于仅表达V2的对照，表明SlRAV2增强了V2的RSS活性。进一步的机制探究表明，V2能够结合21-nt ds siRNA。电泳迁移率变动分析显示，GST-SlRAV2或其C端蛋白的加入，显著增强了V2-His与21-nt ds siRNA探针的结合能力。这些结果说明，SlRAV2通过蛋白质互作，增强了V2结合ds siRNA的能力，从而放大了其RSS功能。
2.4 V2增强SlRAV2介导的SlPR1转录激活
SlPR1是SA防御通路的一个标志性基因。研究发现，过表达SlRAV2能上调SlPR1的表达。启动子反式激活实验表明，SlRAV2能直接激活SlPR1启动子驱动的GUS报告基因表达。更重要的是，当V2与SlRAV2共表达时，GUS活性被进一步提升。EMSA实验证实，SlRAV2能直接结合到SlPR1启动子的一个保守‘CACCTG’基序上，并且V2的存在增强了SlRAV2与该DNA探针的结合。这表明，SlRAV2不仅自身能激活防御基因表达，还能利用与其互作的病毒蛋白V2来放大这一转录调控效应。
SlPR1基因的调控。A) SlRAV2过表达正调控SlPR1表达。B) SlRAV2激活SlPR1启动子。C) V2与SlRAV2共表达进一步增强了启动子活性。D) EMSA显示V2增强了SlRAV2与SlPR1启动子探针的结合。">
2.5 V2影响SlRAV2的亚细胞定位
亚细胞定位分析显示，SlRAV2单独表达时定位于细胞核，而V2则同时定位于细胞核和细胞质。当两者共表达时，SlRAV2的定位发生了变化，从单一的核定位转变为核质共定位，而V2的定位模式不变。核质分离实验的Western blot结果也证实了这一点。进一步的机制研究发现，SlRAV2能与核输入受体Importin α互作，而V2的加入会在体外下拉实验中削弱SlRAV2与Importin α的互作。这表明，V2通过与Importin α竞争性结合SlRAV2，干扰了SlRAV2的核输入过程，导致其部分滞留于细胞质。
3 讨论
本研究揭示了一个由番茄转录因子SlRAV2与TYLCV V2蛋白互作所调控的、精妙且看似矛盾的抗病毒新机制。一方面，V2通过互作改变SlRAV2的亚细胞定位（使其部分进入细胞质），并招募SlRAV2来增强自身与21-nt ds siRNA的结合能力，从而放大了其RSS活性。这导致TYLCV在局部感染叶片中的积累出现短暂升高。另一方面，在细胞核内，V2却出人意料地增强了SlRAV2对其靶基因SlPR1启动子的结合与激活能力。
这种双重调控的最终结果是，局部病毒积累的短暂激增和SlRAV2介导的防御基因（如SlPR1）的强力激活共同作用，引发了局部细胞活性氧的爆发和细胞坏死。这种快速而剧烈的局部超敏反应，如同一道“防火墙”，有效地将病毒限制在最初的感染部位，阻止了其向植株其他部分（系统叶片）的扩散。因此，虽然表面上看是病毒蛋白V2在“利用”宿主因子SlRAV2，但实质上SlRAV2巧妙地“反利用”了这一互作，激活了更强的防御反应来遏制病毒。
SlPR1启动子的调控，最终通过激发局部防御反应抑制TYLCV的系统感染。">
这一发现不仅增进了我们对植物如何利用转录因子与病毒蛋白的“博弈”来实施抗病毒防御的理解，也为未来通过操控SlRAV2或其相关通路来培育抗TYLCV的番茄品种提供了新的潜在靶点和策略。该研究凸显了宿主与病原体在共进化过程中形成的复杂而动态的相互作用网络。
