基于电子供体与固氮酶铁蛋白电子传递距离预测其兼容性的计算模型研究

《Protein Science》：Predicting compatibility between ferredoxins and the Fe protein of nitrogenase using in silico protein modeling

这项研究通过计算蛋白质对接模拟，揭示了固氮相关电子载体（如铁氧还蛋白和 flavodoxin）与固氮酶铁蛋白（Fe protein/NifH）之间辅因子距离更短（≤10 ?），有助于更快的电子隧道速率。研究者发现，辅因子距离比氧化还原电位更能预测电子载体与铁蛋白的兼容性。该发现为将固氮酶引入非固氮生物（如植物）的工程化提供了筛选电子供体的新框架。

　　

引言

生物固氮是指某些细菌和古菌利用固氮酶将大气中的氮气还原为生物可利用的铵的过程。将固氮酶工程化到非固氮生物（如植物）中，可以减少对合成肥料的依赖，并减轻工业肥料生产对环境的影响。固氮酶由两个亚基组成：同源二聚体的铁蛋白（Fe蛋白/NifH）和异源四聚体的钼铁蛋白（MoFe蛋白/NifDK）。其中，铁蛋白依赖于称为铁氧还蛋白（ferredoxin）和黄素氧还蛋白（flavodoxin）的小型电子载体蛋白来接收还原力。成功将固氮酶工程化到新系统中，需要理解这些蛋白电子传递的机制。许多生物体编码多种铁氧还蛋白，因此，预测哪种铁氧还蛋白能与铁蛋白兼容是关键问题。先前研究表明，铁氧还蛋白的氧化还原电位与其支持的固氮酶活性之间没有相关性，促使本研究探索辅因子间的距离是否是一个更好的预测指标。

结果

2.1 支持固氮作用的大多数电子载体的辅因子与铁蛋白[4Fe-4S]簇之间的距离更短（≤10 ?）

研究者使用来自固氮细菌、非固氮细菌和植物的铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白与Rhodopseudomonas palustris的铁蛋白进行计算机蛋白质-蛋白质对接模拟。他们测量了铁蛋白[4Fe-4S]簇与铁氧还蛋白FeS簇或黄素氧还蛋白FMN之间的边对边距离R。结果显示，已知支持固氮作用的电子载体（如RpFer1、RpFldA、AsFdxH、KoNifF等）与铁蛋白之间的平均辅因子距离最短，且往往小于10 ?。这一距离与先前观察到的A. vinelandii中NifF与铁蛋白之间的距离（6.4 ?）一致。

而不支持固氮作用的细菌和植物铁氧还蛋白，其辅因子距离大多超过14 ?。一个例外是植物的线粒体铁氧还蛋白AtMFD2，其辅因子距离在9.2至13.1 ?之间。研究者发现，在工程化E. coli中测得的植物铁氧还蛋白相对固氮酶活性，与模拟计算的辅因子距离范围之间存在显著相关性（R²= 0.644）。这表明，较短的辅因子距离与更有效的铁蛋白电子供体能力相对应。

2.2 支持固氮作用的电子载体具有最快的电子隧道速率

电子隧道速率取决于氧化还原电位差和辅因子间距离。研究者使用经验公式计算了每个电子载体与铁蛋白之间的电子隧道速率。他们发现，已知参与固氮的铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白具有最快的电子隧道速率（>10⁶s^?1）。这甚至适用于Klebsiella的NifF和Anabaena的FdxH，尽管它们的氧化还原电位比铁蛋白更高。这是因为它们更短的辅因子距离弥补了热力学上的不利条件。相反，不参与固氮的细菌和植物铁氧还蛋白的电子隧道速率要慢得多，平均约为10⁴s^?1。

为探索如何改造植物铁氧还蛋白以增强其向固氮酶的电子传递，研究者模拟了不同氧化还原电位（-1000至-200 mV）和辅因子距离（4至20 ?）下的电子隧道速率。结果表明，对于一个氧化还原电位为-321 mV的植物铁氧还蛋白（ZmFd3），若要保持10⁶s^?1的隧道速率，其辅因子距离需要从14.7 ?缩短到10 ?。如果距离保持不变，其氧化还原电位需要降至-850 mV——这对于已知的[2Fe-2S]簇铁氧还蛋白来说是不可能的。因此，缩短辅因子距离可能是提高植物铁氧还蛋白与固氮酶兼容性的更实用策略。

2.3 蛋白质-蛋白质界面处的静电相互作用可能使铁氧还蛋白与铁蛋白的FeS簇更接近

对接模拟表明，较短的辅因子距离对于支持固氮酶活性至关重要。因此，评估电子载体与铁蛋白之间的对接界面，对于识别影响辅因子距离的因素非常重要。已知A. vinelandii中NifF与铁蛋白之间的静电相互作用对其结合很重要。分析显示，R. palustris铁蛋白上的带电荷残基（如精氨酸101 R101、精氨酸140 R140、谷氨酸112 E112和谷氨酸69 E69）在与支持固氮的铁氧还蛋白/黄素氧还蛋白形成盐桥相互作用中非常重要。对多种固氮生物Fe蛋白的多序列比对表明，这些残基是保守的。

研究者发现，参与固氮的铁氧还蛋白表面通常存在带正电和负电的氨基酸簇，这种表面电荷分布有助于与铁蛋白形成盐桥，从而拉近辅因子距离。为验证电荷作用，他们模拟了AnabaenaFdxH的一个变体（AsFdxH^K10E,K11A），该变体已知会导致体外固氮酶活性降低31%。对接模型显示，该变体的平均辅因子距离从10 ?增加到15.3 ?，表明电荷兼容性影响了FeS簇之间的距离，并可能影响固氮酶活性。相比之下，植物铁氧还蛋白表面多为带负电的氨基酸，与铁蛋白的E112和E69形成的盐桥较少，总体上静电相互作用较少，辅因子距离较远。

2.4 与铁蛋白辅因子距离约10 ?的异源铁氧还蛋白可以在R. palustris中支持固氮酶活性

为验证对接模拟的预测能力，研究者在模式固氮菌R. palustris中建立了一个表达平台。他们敲除了该菌中可能与氮传递相关的其他已知电子载体基因（fldA、ferN、badB），并用来自不同细菌的2[4Fe-4S]铁氧还蛋白基因（CpFd、Tm1175、EcFd、CtFdII、Tm1815）替换了主要的固氮铁氧还蛋白基因fer1。对接模型预测，CpFd和Tm1175的平均辅因子距离最短（约10 ?或更短）。

生长实验表明，表达CpFd的菌株生长与野生型相似，表达Tm1175的菌株倍增时间显著变慢但仍能达到高细胞密度。而表达EcFd、CtFd或Tm1815的菌株倍增时间最慢。尽管如此，这些菌株的生长仍优于完全缺失fer1等关键电子载体的菌株，表明它们仍能支持一定程度的固氮。翻译起始速率计算表明，生长差异与蛋白质表达水平没有相关性。这些结果共同表明，预测的辅因子距离可以作为识别与铁蛋白更兼容的铁氧还蛋白的有用代理。

讨论

本研究旨在预测和识别提高蛋白质电子载体与固氮酶铁蛋白兼容性的方法。对接模拟发现，参与固氮的铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白与铁蛋白[4Fe-4S]簇之间的辅因子距离通常更短，大多在10 ?左右。这些距离不应被视为精确的结构预测，而应视为电子载体是否能采样到有利于电子传递的构象的指标，这符合动态对接模型的理论。

该模型还能帮助阐明电子载体的不同功能。例如，在R. capsulatus中，尽管RcFdN和RcFdC在固氮条件下都是必需的，但RcFdC可能并不直接作为固氮酶的电子供体，因为其氧化还原电位较高（约-285 mV），且与铁蛋白的模拟距离较远，支持了其可能作为其他蛋白（如FprA）电子供体的观点。

静电相互作用在稳定对接复合物和影响辅因子排列方面起着重要作用。研究发现，较短的辅因子距离往往伴随着更多的静电相互作用。对FdxH的变体研究表明，减少静电接触会增加辅因子距离，说明特定的电荷相互作用有助于将对接复合物偏向于有利于电子隧道的取向。

虽然电子隧道速率与固氮酶活性相关，但总体电子传递更可能受到铁蛋白与其电子供体结合和解离速率的限制，而非隧道步骤本身。然而，增强植物铁氧还蛋白与铁蛋白之间的静电相互作用，可能使其更频繁地采样到辅因子紧密靠近的构象，从而提高电子传递效率，这对于具有较高氧化还原电位的铁氧还蛋白尤为重要。

辅因子距离可以作为预测电子载体与铁蛋白兼容性的有用初筛指标。体内实验证实了这一点：预测距离最短的两个铁氧还蛋白（CpFd和Tm1175）支持了R. palustris更快的生长。值得注意的是，CpFd来自已知的固氮菌，而Tm1175来自不固氮的T. maritima，这表明辅因子距离的预测能力可以识别出此前未知的、但具有潜在兼容性的电子供体。

当然，除了距离之外，其他因素（如蛋白质丰度、特定铁氧还蛋白还原酶的存在、FeS簇的占有率等）也会影响异源铁氧还蛋白支持固氮酶的能力。尽管如此，将辅因子距离作为初始筛选标准，有助于在将固氮作用工程化到新宿主时，优先选择候选电子载体进行实验测试。