利用RPGRorf15纳米孔长读长测序技术提升男性和女性视网膜色素变性的分子诊断水平

《Human Genetics》：RPGRorf15 nanopore long-read sequencing improves retinitis pigmentosa molecular diagnosis for men and women

为解决因复杂重复序列导致传统短读长测序对RPGRorf15区域分析困难、致使大量视网膜变性病例无法确诊的问题，研究人员应用牛津纳米孔技术对194例疑似遗传性视网膜病患者进行长读长测序，成功在27例患者中检出致病性变异，证实了该技术对男性及女性（包括携带者与患病者）进行高效、准确诊断的有效性，对提升遗传性眼病诊断率具有重要意义。

　　

遗传性视网膜变性是一类严重影响视力的遗传性眼病，其中由RPGR基因突变引起的X连锁视网膜色素变性占有重要比例。然而，精准揪出导致疾病的“元凶”基因突变，有时却像大海捞针，尤其是当这个基因存在一段名为ORF15的“顽固分子”时。这段区域富含重复序列，结构复杂，导致常规的第一代和第二代短读长测序技术对它束手无策，无法有效读取和比对，造成了大量临床患者的分子诊断“悬案”。这不仅阻碍了患者的确诊，也影响了后续可能的精准治疗与遗传咨询。因此，开发一种能够“啃下”这块硬骨头的测序技术，成为临床遗传诊断领域的迫切需求。

近期，一项发表在《Human Genetics》上的研究，为我们带来了破局的利器。研究团队另辟蹊径，采用第三代长读长测序技术——牛津纳米孔测序，专门攻克RPGR^{orf15这个测序难点，成功提升了视网膜色素变性的分子诊断率，并且证明这项技术对男性和女性患者（包括携带者）都同样有效。}

研究者们运用了几个关键技术方法：首先，他们建立了一个由194名视网膜变性（RD）患者组成的队列，这些患者均在一线检测（对包含230个视网膜变性基因的panel进行二代测序，并涵盖RP2和RPGR^{ex1-19）后结果为阴性。其次，研究采用特异引物对ORF15区域进行长片段PCR扩增，构建测序文库。最后，核心步骤是使用牛津纳米孔PromethION 2平台进行长读长测序，产生的数据进行碱基识别后，利用GRCh38参考基因组进行比对，并通过IGV和Alamut? Visual Plus软件进行变异的人工分析与注释。}

研究结果

队列描述

研究纳入了194名患者（142名男性，52名女性），其中42名怀疑为X连锁遗传，152名怀疑为常染色体遗传或散发。所有患者均因早期和/或严重病变被纳入，但一线基因检测未发现致病性变异。

长读长测序指标

在验证阶段，测序能够产生覆盖整个ORF15区域的长读长，平均深度高，覆盖度（≥30X）达到100%。对已知阳性对照的致病性变异均能正确检出。在正式患者测序中，通过优化运行参数（如每半小时进行一次“孔扫描”），获得了足量的测序数据用于分析。

鉴定ORF15致病性变异

通过长读长测序，在27名患者（13.9%）中发现了致病性ORF15变异，包括21名男性和6名女性。在怀疑为X连锁遗传的42名患者中，有15人（35.7%）携带变异；而在另外152名怀疑为其他遗传方式的患者中，也有12人（7.9%）检出变异，且均为男性。共发现18种不同的致病变异，均为截短变异（无义或移码），其中4种为新发现的变异。值得注意的是，位于ORF15 3’端（对应于氨基酸1024之后）的变异均与锥杆细胞营养不良或锥细胞营养不良相关，而未发现与杆锥细胞营养不良相关。

相关女性携带者的长读长测序分析

研究还对26名男性先证者的女性亲属进行了靶向长读长测序，成功在10名（38.5%）有X连锁视网膜变性家族史的女性中鉴定出ORF15变异，证明了该技术对女性携带者进行分析的便捷性和有效性。

携带c.2719G>T变异家族的临床表型

c.2719G>T是本研究中发现的最常见变异之一，在5名无亲属关系的男性患者中检出，且他们都来自法国上法兰西大区，提示可能存在奠基者效应。对一个携带该变异家族的详细临床分析显示，患病男性主要表现为X连锁锥杆细胞营养不良，女性携带者则表型不一，从无症状仅眼底有携带者征象，到单眼发病均有可能。

讨论与结论

这项研究证实，长读长纳米孔测序是分析复杂重复区域ORF15、解决一线短读长测序阴性病例的有效手段。其诊断率在疑似X连锁病例中达到35.7%，在散发或疑似常染色体病例中也达到了7.9%，显著提升了RPGR相关视网膜变性的确诊能力。研究不仅验证了该技术检测男性半合子变异的可靠性，更凸显了其在分析女性杂合子变异方面的独特优势，为女性携带者和患病者的分子诊断提供了高效工具。

技术层面，虽然长读长测序表现优异，但研究也指出其在高度重复区域可能存在的注释错误问题，必要时仍需桑格测序进行验证。此外，通过表型-基因型关联分析，研究支持了既往观察，即ORF15变异的位置与疾病类型相关，其3’端的变异更倾向于导致以视锥细胞功能受损为主的疾病（锥杆或锥细胞营养不良）。

总之，该研究系统性评估并确立了牛津纳米孔长读长测序在RPGR^{orf15变异检测中的临床应用价值。它为解决这一长期困扰遗传性眼病诊断的技术难题提供了直接、高效的方案，有望成为疑似X连锁病例的一线检测方法，以及一线常规基因检测阴性病例的重要二线补充手段，从而让更多患者获得明确的分子诊断，为未来的个性化治疗和遗传咨询奠定基础。}