《Immunogenetics》：Class switched bovine ultralong CDR H3 amplicons versus canonical in immune and non-immune tissues
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本研究针对牛免疫系统中一类独特的超长互补决定区3（ultralong CDR H3）抗体的组织分布及其最终关联的同种型尚不明确的问题，研究人员通过对24个牛组织样本中经典与超长CDR H3抗体的五种免疫球蛋白同种型（IgM、IgD、IgG、IgA、IgE）扩增子进行分析与定量，发现超长CDR H3抗体倾向于类别转换为IgG同种型，尤其在引流免疫部位的咽后内侧淋巴结中；同时，骨髓中产生经典抗体的B细胞也大多转换为IgG。这表明超长CDR H3可能对处理某些抗原具有独特优势，相关发现为深入理解牛免疫系统功能以及开发牛健康与人类免疫治疗新策略提供了宝贵见解。
在脊椎动物的免疫系统中，抗体（又称分泌型免疫球蛋白，Ig）的产生是中和外来物质的关键适应机制。牛的免疫系统拥有一种独特的武器库：除经典的免疫球蛋白外，还存在一类被称为“超长互补决定区3”（ultralong complementarity-determining region 3， CDR H3）的抗体。这些抗体的重链可变区拥有异常延长的CDR3环，长度可达40-70个氨基酸，相比之下，人类的CDR H3通常仅为8-16个氨基酸。这种超长结构赋予它们更小或更延长的抗原结合面（paratope），有望触及经典抗体难以企及的“隐藏”抗原表位，例如在人类免疫缺陷病毒（HIV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等复杂病毒上。
然而，尽管人们对这类“牛抗体”（cattlebodies）的结构和产生机制已有不少了解，关于它们在牛体内各个组织中的分布情况，以及它们最终与哪种免疫球蛋白同种型（IgM、IgD、IgG、IgA、IgE）相结合，仍知之甚少。这些抗体是否像经典抗体一样，会在免疫应答过程中发生类别转换（class switching）？它们在免疫组织和非免疫组织中的表达模式有何不同？解答这些问题，对于理解这类特殊抗体在牛整体免疫系统中的作用，以及挖掘其在牛健康管理和人类新型免疫疗法（如针对难治性病原体的广谱中和抗体开发）中的应用潜力，至关重要。
为了填补这一知识空白，一项发表在《Immunogenetics》上的研究应运而生。研究人员决定对两只高度免疫化的两岁龄布兰格斯（Brangus）阉牛进行深入探究，系统分析其全身24种不同组织（包括系统组织、次级淋巴组织、胃肠道组织以及造血和循环免疫组织）中，经典与超长CDR H3抗体的表达谱和类别转换情况。
研究人员开展这项研究主要运用了以下几个关键技术方法：首先，从两只免疫了不同人类蛋白（TIM-3或PD-1胞外域）的阉牛的24种组织中采集样本并提取RNA，合成互补DNA（cDNA）。其次，他们设计了针对五种免疫球蛋白同种型（IgM、IgD、IgG、IgE、IgA）恒定区以及超长与经典重链可变区保守序列的特异性引物，通过高保真聚合酶链式反应（PCR）扩增出免疫球蛋白重链可变区至CH1结构域的片段。然后，利用Illumina平台对这些带有组织特异性条形码的扩增子进行测序。最后，通过生物信息学分析，将测序读段比对到经典和超长的种系参考序列，依据CDR3长度和恒定区序列对序列进行分类、定量和统计分析，从而描绘出两种抗体类型在不同组织和同种型中的分布图谱。
研究结果
CDR H3长度分布
分析显示，两头牛的CDR H3氨基酸长度分布高度相似，呈现典型的三峰分布：一个≤11个氨基酸的肩峰，一个12-39个氨基酸的主峰（被定义为经典CDR H3），以及一个≥40个氨基酸的峰（被定义为超长CDR H3）。平均而言，经典CDR H3长度约为22个氨基酸，而超长CDR H3平均长度接近60个氨基酸。绝大多数超长CDR H3序列使用了特定的种系基因片段：IGHV1-7（包含编码TTVHQ基序的8碱基对重复）、IGHD8-2（富含半胱氨酸）和IGHJ2-4。
同种型分布
在所有组织内，经典与超长CDR H3抗体中五种同种型的分布模式在两头牛中基本一致。总体来看，经典CDR H3抗体的扩增子数量远高于超长型，尤其在IgM和IgG同种型中占主导。相比之下，超长CDR H3抗体显示出明显的类别转换倾向。统计结果显示，超长CDR H3抗体有77.1%转换为已转换同种型（IgG、IgE、IgA），而经典抗体中这一比例为54.6%。更重要的是，超长抗体优先转换为IgG同种型，这一趋势具有高度统计学显著性（P < 0.0001）。
组织特异性类别转换
进一步的组织水平分析发现，超长CDR H3抗体在所有组织中均表现出比经典抗体更高的已转换与未转换（IgM/IgD）同种型比例。其中，骨髓（BOMA） 的转换比最高，达到7.2。此外，咽后内侧淋巴结（MRLN）——作为免疫注射部位的引流淋巴结——其超长CDR H3抗体中IgG同种型的绝对扩增子数量是所有组织和同种型组合中最高的。其他如胆囊（GALL）、下颌淋巴结（MALN）、肠系膜淋巴结（MELN）和外周血单核细胞（PBMC）等组织也显示出显著较高的转换比例。
交互作用分析
复杂的交互作用分析揭示了更多细节：
- 1.
在超长CDR H3长度范围内，同种型与组织间存在显著的交互效应（P < 0.0001），再次突出了咽后内侧淋巴结中IgG的突出表达。
- 2.
在六个特定组织（包括肺尾叶、肌肉、骨髓、下颌淋巴结、咽后内侧淋巴结和肠系膜淋巴结）中，CDR H3长度和同种型存在显著的交互效应。在这些组织中，经典抗体的IgM和IgG表达量均显著高于任何超长抗体同种型的组合。
- 3.
仅在IgG同种型中，CDR H3长度与组织间存在显著交互效应（P < 0.0001），表明IgG的表达模式在经典与超长抗体间因组织不同而异。
半胱氨酸含量
分析还发现，超长CDR H3序列中的半胱氨酸百分比总体上高于经典CDR H3（平均高出1.3%），这与其依赖二硫键形成“柄-球”结构（stalk and knob）的特性相符。
研究结论与讨论
本研究首次对超免疫化牛体内多种组织中经典与超长CDR H3抗体的表达进行了深入的组织学表征。主要结论是：超长CDR H3抗体在牛体内广泛存在，但表达水平低于经典抗体；它们表现出强烈的类别转换倾向，尤其偏好转换为IgG同种型；这种转换在骨髓和引流淋巴结（如咽后内侧淋巴结）中尤为显著。
这些发现具有多重意义。首先，它证实了超长CDR H3抗体能够并确实经历了完整的生发中心反应（包括体细胞高频突变和类别转换），暗示它们是对特定抗原进行有效、成熟免疫应答的一部分。其次，研究指出了关键的组织部位：骨髓中高比例的转换可能意味着产生超长抗体的记忆B细胞或长寿命浆细胞归巢至此；而引流淋巴结中IgG型超长抗体的高丰度，则直接关联于局部的抗原刺激和免疫反应。
研究人员在讨论中指出，超长CDR H3抗体独特的结构（其延伸的“柄”和稳定的、富含二硫键的“球”状 knob 域）使其能够触及传统抗体无法结合的隐蔽或保守的病毒表位。这已经在针对HIV和SARS-CoV-2的广谱中和抗体研究中得到验证（例如，Sok et al., 2017; Huang et al., 2023）。因此，理解这些抗体在牛体内的自然分布和转换规律，不仅增进了对牛本身免疫生理学的认识，更重要的是，为有目的地利用或模仿这类抗体设计新型疫苗和疗法提供了理论依据。例如，可以探索如何优化免疫策略，以在牛或工程化平台上更有效地诱导产生针对特定人类病原体的超长CDR H3中和抗体。
当然，研究也存在一些局限性，如样本来自特定品种和年龄的免疫化个体，未来需要纳入更多变量（如年龄、品种、常规疫苗接种史）以获取更具代表性的数据。此外，进一步分析不同IgG亚类（IgG1、IgG2、IgG3）的分布、体细胞高频突变模式以及驱动类别转换的细胞因子信号，将有助于更精细地解析超长CDR H3抗体的免疫生物学。
总而言之，这项研究填补了牛超长CDR H3抗体组织分布知识的空白，清晰地描绘了其倾向于类别转换为IgG的免疫轨迹，并强调了骨髓和引流淋巴结在其中的关键作用。这些见解不仅深化了对牛这种重要农业动物免疫系统的理解，也为未来开发基于这类特殊抗体结构的创新性生物医药工具，以应对人类和动物健康领域的挑战，开辟了新的道路。
