《Exploration》：Rumen Mycobiome Thiamine Metabolism Contributes to Subacute Rumen Acidosis Tolerance in Goats Through Enhancing Epithelial Cell Proliferation via IGFBP2/IGF1 Axis Activation
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本研究首次系统揭示了瘤胃真菌在亚急性瘤胃酸中毒（SARA）耐受性中的关键作用。通过多组学分析发现，耐受型山羊瘤胃中家蚕曲霉（Aspergillus bombycis） 的富集增强了硫胺素（维生素B1）代谢，进而下调瘤胃上皮miRNA chi-miR-17-26080，解除其对胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）的抑制。上调的IGFBP2促进IGF1募集，激活PI3K/AKT和ERK信号通路，驱动上皮基底层和棘层细胞增殖，从而增强挥发性脂肪酸（VFAs）吸收能力，维持瘤胃pH稳定，最终提升山羊对高精料饮食诱导的SARA的耐受性。这为通过靶向瘤胃真菌代谢干预反刍动物代谢疾病提供了新思路。
文章内容归纳总结：
引言
亚急性瘤胃酸中毒（Subacute Rumen Acidosis, SARA）是反刍动物常见的代谢性疾病，主要表现为瘤胃pH值持续偏低（低于5.6或5.8超过180分钟/天），主要由高精料日粮发酵产生的挥发性脂肪酸（Volatile Fatty Acids, VFAs）在瘤胃内积累所引发。SARA会破坏瘤胃上皮屏障，诱发上皮炎症，严重影响产奶量和动物健康。尽管个体对SARA的易感性存在差异，但其背后的微生物机制，尤其是除细菌外的瘤胃真菌（真菌组）的作用，尚不明确。瘤胃上皮是吸收VFAs、维持瘤胃内环境稳定的关键部位，其细胞亚型（如基底层细胞、棘层细胞、颗粒层细胞）的构成和功能变化可能与SARA耐受性相关。微生物与宿主之间的互作常通过微小RNA（miRNA）调控基因表达来实现。因此，本研究旨在通过整合瘤胃微生物组（尤其是真菌组）、瘤胃上皮单细胞转录组、转录组和miRNA组测序数据，揭示瘤胃真菌代谢功能如何通过调控上皮miRNA表达，影响上皮细胞亚型，进而决定山羊对SARA耐受性的分子机制。
结果
1. SARA的发生与瘤胃上皮炎症
通过监测高精料饲喂后瘤胃pH动态变化，研究成功构建了SARA易感（HCS）和SARA耐受（HCT）山羊模型。与对照组（CON）和HCT组相比，HCS组山羊血浆中促炎因子TNF-α和IL-17浓度显著升高，而抗炎因子IL-10浓度降低。瘤胃上皮转录组分析显示，HCS组山羊上调的基因显著富集在NF-κB、IL-17、TNF和Toll样受体等炎症与免疫反应相关信号通路，表明SARA发生伴随着显著的瘤胃上皮炎症。
2. HCT山羊维持正常的瘤胃上皮状态与VFAs吸收能力
与HCS组不同，HCT组山羊瘤胃上皮基因上调主要富集在细胞增殖、能量代谢相关通路。尽管瘤胃液VFAs浓度无显著差异，但HCT组山羊血浆中总VFAs和丙酸比例显著高于HCS组，而乙酸/丙酸比值更低，提示其VFAs吸收能力更强。组织学观察发现，HCT组山羊瘤胃上皮乳头更宽，角质层完整，细胞层次清晰，而上皮结构在HCS组山羊中出现损坏。
3. 上皮细胞在HCT山羊中增加，而免疫细胞在HCS山羊中增加
瘤胃上皮单细胞核RNA测序（snRNA-seq）分析揭示了上皮细胞、内皮细胞、T细胞、巨噬细胞等多种细胞类型。HCS组山羊上皮细胞比例降低，而CD4+T细胞和巨噬细胞比例升高。相反，HCT组山羊上皮细胞比例更高。对上皮细胞进行亚群细分，发现HCT组山羊的基底层细胞和棘层细胞数量增加，而HCS组山羊的颗粒层细胞增多。基底层和棘层细胞高表达VFAs吸收相关基因（如SLC16A1、SLC4A9）。基因集评分显示，与VFAs吸收相关的基因在HCT组山羊的棘层细胞中表达更高。
4. 瘤胃真菌物种与功能的差异
瘤胃微生物组测序发现，真菌约占瘤胃微生物的1.71%。HCT组山羊瘤胃真菌的相对丰度高于HCS和CON组。在物种组成上，HCS和HCT组山羊中一些典型的厌氧真菌（如Orpinomyces sp. UKK1, Piromyces sp.）的丰度均低于CON组。然而，与CON和HCS组相比，HCT组山羊瘤胃中家蚕曲霉（Aspergillus bombycis） 和Podospora comata的丰度显著增加。功能分析表明，HCS组山羊瘤胃真菌的碳水化合物和氨基酸代谢功能减弱，而HCT组山羊瘤胃真菌的硫胺素（thiamine）代谢功能显著增强。
5. 家蚕曲霉与硫胺素代谢的关键作用
进一步分析发现，HCT组山羊瘤胃真菌中硫胺素代谢通路的富集与家蚕曲霉的丰度增加密切相关。Spearman相关性分析显示，家蚕曲霉的丰度与血浆硫胺素含量呈显著正相关。对家蚕曲霉单菌株基因组的分析证实，其基因组中包含完整的硫胺素合成途径相关基因（如NFS1），具备从头合成硫胺素的能力。此外，HCT组山羊瘤胃真菌的碳水化合物活性酶（CAZy）中，纤维素降解酶GH9模块增加。
6. miRNA介导的基因表达调控
瘤胃上皮miRNA测序发现，与CON和HCS组相比，HCT组山羊有多条miRNA表达下调。这些下调miRNA的预测靶基因显著富集在细胞增殖（如PI3K-Akt、Hippo、MAPK信号通路）、细胞连接（如黏着斑、紧密连接）和代谢相关通路。miRNA-mRNA关联分析筛选出在HCT组中表达呈负相关的调控对。
7. 多组学关联揭示真菌-miRNA-宿主基因调控轴
Spearman相关性分析将瘤胃真菌、miRNA和上皮基因表达联系起来。家蚕曲霉的丰度与多个miRNA（如chi-miR-17-26080）呈负相关，而这些miRNA在HCT组中表达下调。其中，chi-miR-17-26080的预测靶基因是胰岛素样生长因子结合蛋白2（Insulin-like growth factor binding protein 2, IGFBP2）。双荧光素酶报告基因实验证实，chi-miR-17-26080可直接靶向抑制IGFBP2的表达。在HCT组山羊中，随着chi-miR-17-26080表达下调，IGFBP2的表达显著上调。
8. 硫胺素饲喂验证其缓解SARA及促进增殖的机制
为了验证硫胺素的作用，研究在高精料日粮（HCD）中添加硫胺素（HCD-T组）进行饲喂实验。结果发现，补充硫胺素显著降低了瘤胃上皮中chi-miR-17-26080的表达，缓解了上皮炎症因子（如IL-1β, IL-17）的上调，并促进了细胞周期蛋白Cyclin A2和CDK4的表达。更重要的是，HCD-T组山羊瘤胃上皮中IGFBP2和IGF1的蛋白表达水平显著升高，并伴随着蛋白激酶B（AKT）和细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化水平增强，表明IGFBP2/IGF1-PI3K/AKT和IGFBP2/IGF1-ERK信号通路被激活。这些变化共同促进了瘤胃上皮细胞的增殖。
讨论
本研究系统阐述了瘤胃真菌组，特别是家蚕曲霉，在反刍动物SARA耐受性中的新颖机制。高精料饮食下，耐受型山羊瘤胃富集了具有增强硫胺素代谢能力的家蚕曲霉。增加的硫胺素可能通过下调瘤胃上皮细胞中的chi-miR-17-26080，解除其对IGFBP2的转录抑制。高表达的IGFBP2通过募集并激活IGF1，进而启动下游的PI3K/AKT和ERK信号通路，最终上调细胞周期蛋白，驱动瘤胃上皮基底层和棘层细胞的增殖。更多具有VFAs吸收功能的基底层和棘层细胞增强了瘤胃对VFAs的吸收效率，减少了VFAs在瘤胃中的累积，从而有助于维持瘤胃pH稳定，避免SARA的发生。这突破了以往SARA研究主要关注细菌组的局限，首次揭示了真菌代谢物硫胺素通过一条清晰的miRNA-IGFBP2/IGF1信号轴调控上皮稳态和宿主代谢表型的完整途径，为通过营养干预（如补充硫胺素）或微生物调控（如益生真菌）预防和治疗反刍动物SARA提供了重要的理论依据和潜在靶点。
实验方法
研究包括动物实验模型构建（CON、HCS、HCT组及硫胺素添加组）、瘤胃液与血液样本采集、VFAs和炎症因子检测、组织形态学分析、瘤胃上皮单细胞核RNA测序、瘤胃微生物宏基因组测序、瘤胃上皮转录组与miRNA测序、以及荧光定量PCR、Western Blot、双荧光素酶报告基因实验等分子生物学验证。生物信息学分析涵盖了差异表达分析、通路富集分析、相关性分析、网络构建等。
结论
本研究首次阐明，瘤胃真菌家蚕曲霉通过增强硫胺素代谢，下调瘤胃上皮chi-miR-17-26080表达，进而解除对IGFBP2的抑制。上调的IGFBP2通过激活IGF1-PI3K/AKT和IGF1-ERK信号轴，促进瘤胃上皮细胞增殖，特别是增强VFAs吸收的基底层和棘层细胞，从而改善VFAs代谢，提升山羊对高精料诱导的SARA的耐受性。该发现揭示了瘤胃真菌代谢在反刍动物宿主代谢健康中的关键作用，为靶向微生物-宿主互作防治反刍动物代谢疾病提供了新策略。
