《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Unaltered NKG2D-CAR T cell function under hypoxia in osteosarcoma in vitro
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本研究旨在探讨实体瘤免疫治疗的主要障碍——肿瘤缺氧微环境，是否会影响靶向NKG2D的嵌合抗原受体（CAR）T细胞在骨肉瘤（OS）中的疗效。研究人员通过体外模型系统评估了缺氧条件下NKG2D-CAR T细胞的功能。研究结果表明，缺氧并未影响NKG2D配体（NKG2DL）及主要免疫检查点（IC）的表达，且NKG2D-CAR T细胞的表型、细胞毒性及细胞因子分泌功能均保持完好。这一发现挑战了“缺氧单独损害CAR T细胞疗效”的传统观点，强调了肿瘤微环境中多因素协同作用的重要性，为优化针对骨肉瘤等实体瘤的CAR T细胞疗法提供了新的思路。
在儿童和青少年的癌症死亡原因中，骨肉瘤（Osteosarcoma， OS）作为一种常见的原发性骨癌占据了重要位置。尽管化疗和手术等传统治疗手段使局部肿瘤患者的五年生存率达到了约70%，但对于复发或发生转移的患者，其生存率在过去三十年中仍停滞在30%左右，改善微乎其微。因此，寻找新的有效疗法迫在眉睫。嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor， CAR）T细胞疗法作为免疫治疗的一种，在血液系统恶性肿瘤中取得了革命性的成功，但在骨肉瘤等实体瘤中的应用却屡屡受挫。其中一个被广泛归咎的“元凶”便是实体瘤内部普遍存在的缺氧肿瘤微环境（Tumor Microenvironment， TME）。缺氧被认为是促进肿瘤增殖、转移并导致治疗失败的关键因素，传统观点认为它会抑制免疫细胞的功能，是CAR T疗法难以逾越的障碍。
然而，一项最新发表在《Cancer Immunology， Immunotherapy》上的研究却对这一传统观念提出了挑战。该研究聚焦于一种靶向NKG2D（一种重要的激活性免疫受体）的CAR T细胞（NKG2D-CAR T），深入探究了在体外模拟的缺氧条件下，这类细胞对抗骨肉瘤的能力是否真的会受到抑制。研究得出的核心结论令人意外：缺氧本身，并未削弱NKG2D-CAR T细胞对抗骨肉瘤的“战斗力”。
为了解答缺氧是否影响疗效这一核心问题，研究人员运用了一系列关键技术方法。他们首先建立了人源骨肉瘤细胞系（如143B， MNNG/HOS）的异种移植小鼠模型，用于评估NKG2D-CAR T细胞的体内疗效。在体外，研究人员使用缺氧培养箱精确控制氧气浓度（1% O2）来模拟肿瘤缺氧微环境。研究涉及了来自健康捐赠者的外周血单个核细胞（PBMC），并从中分离T细胞，通过慢病毒转导构建NKG2D-CAR T细胞。关键的功能性实验包括：通过流式细胞术分析细胞表型、免疫检查点及NKG2D配体（NKG2D Ligands， NKG2DL）的表达；利用基于荧光素酶的细胞活性检测和7-AAD染色来量化CAR T细胞的细胞毒性；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子（如IFN-γ， TNF-α， IL-2）的分泌；以及建立三维（3D）骨肉瘤球体模型，在更接近实体瘤结构的环境中评估CAR T细胞的浸润和杀伤能力。此外，还通过免疫荧光和免疫组织化学技术检测了缺氧标志物HIF-1α的表达。
研究结果部分详细呈现了以下发现：
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NKG2D-CAR T细胞在体外展现强效细胞毒性，但在体内未能控制肿瘤生长：在体外，即使效应细胞与靶细胞比例（E/T ratio）低至1:1000，NKG2D-CAR T细胞也能有效清除143B骨肉瘤细胞，显示了强大的抗肿瘤活性。然而，在异种移植小鼠模型中，单次静脉输注NKG2D-CAR T细胞并未能显著控制肿瘤生长，凸显了体内肿瘤微环境的抑制作用。
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OS异种移植肿瘤表达HIF-1α：对小鼠肿瘤组织的分析显示HIF-1α显著表达，证实了骨肉瘤模型中存在缺氧微环境。体外实验也成功诱导了骨肉瘤细胞中HIF-1α的表达，且不影响细胞活力，从而建立了可用于研究缺氧影响的体外模型。
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缺氧不影响OS细胞系中NKG2D配体的体外表达：尽管在体内肿瘤发展过程中观察到部分NKG2D配体（如MICA， MICB， ULBPs）的下调，但在体外模拟的缺氧条件下，这些配体的表达并未发生统计学上的显著变化。这表明缺氧并非导致靶抗原丢失的主要原因。
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OS中免疫检查点的表达不受缺氧调节：研究人员系统评估了骨肉瘤细胞系上一系列抑制性（如B7-H3， CD73， PD-L1）和激活性（如OX40L， 4-1BBL）免疫检查点的表达。结果发现，虽然不同细胞系间表达模式存在差异，但缺氧处理并未显著改变任何所检测免疫检查点的表达水平。
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NKG2D-CAR T细胞功能在缺氧条件下未发生改变：这是本研究最关键的发现。在缺氧条件下，NKG2D-CAR T细胞对骨肉瘤细胞的杀伤能力与常氧条件下相当。其细胞表型（包括激活、功能、耗竭标记物以及线粒体膜电位）、连续多轮杀伤肿瘤细胞的能力均未受影响。细胞因子分泌方面，IFN-γ和TNF-α水平保持不变，而IL-2的分泌甚至在缺氧条件下有所增加。
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NKG2D CAR T细胞在缺氧条件下能有效靶向OS球体：在更接近实体瘤结构的三维球体模型中，NKG2D-CAR T细胞同样能够有效地破坏球体结构并杀伤肿瘤细胞，且其效力在缺氧与常氧条件下无差异，进一步证明了缺氧并非其功能屏障。
在讨论与结论部分，研究者对上述发现进行了深入阐释。本研究挑战了将缺氧视为CAR T细胞治疗骨肉瘤主要障碍的普遍假设。尽管骨肉瘤肿瘤中存在缺氧区域（由HIF-1α表达证实），并且NKG2D-CAR T细胞在体内模型中疗效有限，但详细的体外分析表明，缺氧本身既没有降低CAR T细胞识别靶标（NKG2D配体）的能力，也没有上调关键的免疫抑制检查点，更重要的是，没有损害NKG2D-CAR T细胞的核心功能——包括杀伤肿瘤、产生效应细胞因子以及维持健康的代谢状态。
这一发现具有重要意义。它提示我们，骨肉瘤等实体瘤对CAR T细胞的抵抗是一个多因素共同作用的复杂结果。单纯归咎于缺氧可能过于简化。研究的深层含义在于，未来优化CAR T细胞治疗策略时，需要将目光超越单一的缺氧因素，转而关注肿瘤微环境中其他可能协同作用的压力因素，例如营养剥夺、代谢废物堆积、抑制性细胞因子网络以及各类免疫抑制细胞（如髓系来源抑制细胞MDSCs）的招募和极化。这些因素可能与缺氧相互作用，共同塑造了一个抑制CAR T细胞浸润、持久性和功能的微环境。
因此，该研究不仅为NKG2D-CAR T细胞治疗骨肉瘤的潜力提供了进一步的支持性数据，更重要的是，它修正了我们对肿瘤微环境抑制机制的理解，为开发更有效的组合疗法（例如，CAR T细胞联合靶向其他微环境因素的药物）指明了新的探索方向。要突破实体瘤免疫治疗的瓶颈，必须系统地解构肿瘤微环境这个“黑箱”，而这项研究正是迈向该目标的重要一步。
