《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Stoking an anti-liver cancer immune response with cryoablation plus an intratumoral TLR9 agonist and dual checkpoint inhibitors
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为应对肝细胞癌(HCC)高复发率和免疫抑制性肿瘤微环境(TME)对免疫疗法的限制，研究人员开展了冷冻消融(Cryo)、瘤内TLR9激动剂CpG与双免疫检查点抑制剂(CPI)联合疗法的实验研究。结果表明，三联疗法(Cryo+CpG+CPI)能最有效控制原发与远端肿瘤生长、重塑TME、提升细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能并显著延长生存期，为克服肝癌免疫耐受提供了新策略。
肝脏是人体的重要代谢和解毒器官，但近年来，一种名为肝细胞癌(HCC)的原发性肝癌发病率却不断攀升。尤其令人担忧的是，伴随代谢功能障碍相关的脂肪性肝炎(MASH)的流行，HCC的负担日益加重。尽管现有手术切除或局部消融等根治性治疗手段，但高达60%-85%的患者仍面临复发风险，晚期患者的预后更是堪忧。背后的一个重要“帮凶”是肿瘤微环境(TME)——一个由肿瘤细胞、免疫细胞、信号分子等构成的复杂生态系统。在HCC中，TME往往呈现高度的免疫抑制状态，像是一道坚固的屏障，限制了当前热门免疫检查点抑制剂(CPI)等免疫疗法的效果。肿瘤细胞会“伪装”自己，并招募调节性T细胞(Tregs)和髓源性抑制细胞(MDSCs)等“抑制性部队”来削弱人体免疫系统的攻击能力。因此，科学家们迫切需要创新策略来打破这种免疫抑制，唤醒机体自身的抗癌潜力。
在此背景下，一项发表在《Cancer Immunology, Immunotherapy》杂志上的研究应运而生。研究人员构想了一种组合拳式的疗法：首先，利用冷冻消融(Cryo)技术“冻死”部分肿瘤，在破坏癌细胞的同时释放出肿瘤相关抗原(TAAs)，相当于向免疫系统“暴露”了敌人的特征。紧接着，向瘤内注射一种名为CpG的TLR9激动剂，它可以作为免疫“佐剂”，强烈激活树突状细胞等抗原呈递细胞(APCs)，提升免疫系统对肿瘤抗原的识别和警报能力。最后，系统性施用双免疫检查点抑制剂(CPI)，即同时阻断PD-1和CTLA-4这两个关键的免疫“刹车”信号，从而解除对细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)等“攻击部队”的抑制，让它们能全力攻击肿瘤。该研究旨在验证，这种将局部物理破坏、局部免疫刺激和系统性免疫解放三者结合的策略，能否协同作用，在肝癌中激发强大且持久的抗肿瘤免疫反应。
为了验证这一假设，研究团队主要采用了以下几项关键技术方法：首先，建立了一个模拟人类疾病特征的双肿瘤原位肝癌小鼠模型。研究者给小鼠喂食诱导MASH的西方饮食，然后通过超声引导将RIL-175肝癌细胞系原位注射到小鼠肝脏的两个不同肝叶中，从而形成可分别处理的“原发”肿瘤和未受直接治疗的“卫星”肿瘤。其次，实施了精密的组合治疗干预。小鼠被随机分为8组，分别接受假手术对照、单药治疗（仅Cryo、仅瘤内CpG、仅系统双CPI）以及各种组合治疗，其中三联疗法组同时接受Cryo、瘤内CpG和系统双CPI。Cryo采用不完全消融方案，CpG沿消融边缘分次注射，双CPI则通过腹腔注射给予。最后，运用了多组学分析手段评估疗效与机制。通过活体超声长期监测肿瘤体积变化和生存期，采用流式细胞术深度分析肿瘤组织和外周血中各类免疫细胞（如CTLs, Tregs, MDSCs）的频率、活化状态（如CD69+, CD137+）和耗竭标志物（如PD-1, CTLA-4）表达，利用无监督聚类对T细胞亚群进行精细划分，通过电化学发光多重检测技术分析血清细胞因子动态变化，并借助免疫组织化学染色在组织切片水平观察CD8+T细胞的浸润情况。
研究结果部分通过一系列翔实的数据揭示了不同疗法的效果与机制：
组合疗法（冷冻消融联合TLR9免疫刺激与双检查点抑制）最大程度抑制了肿瘤生长
治疗一周后，所有包含CPI的治疗方案均能显著抑制原发（经治疗）肿瘤的生长。尤为重要的是，单独使用冷冻消融会意外地促进远端卫星肿瘤的生长，这提示单纯的物理消融可能诱导了系统性免疫抑制。然而，当冷冻消融与CpG和/或CPI联合使用时，这种促生长效应被逆转。其中，冷冻消融、CpG与双CPI的三联疗法展现出最强的肿瘤控制效果，并能显著延长小鼠的生存期，半数小鼠存活超过120天，而对照组中位生存期仅7天。
CPI促进细胞毒性T淋巴细胞扩增，而冷冻消融联合CpG促进早期细胞毒性T淋巴细胞活化
流式细胞分析显示，双CPI是驱动细胞毒性T淋巴细胞在肿瘤内扩增的最主要因素。而冷冻消融联合CpG的治疗，则在原发肿瘤内诱导了最高水平的早期活化标志物CD69+细胞毒性T淋巴细胞，表明该组合能有效启动局部T细胞免疫应答。但持续活化标志物CD137+的细胞毒性T淋巴细胞在CPI治疗组中反而降低，可能反映了CPI将耗竭T细胞从功能抑制状态“解救”出来，使其表型发生转变。
CPI或联合疗法增加效应细胞毒性T淋巴细胞，而CpG联合CPI增强效应与初始细胞毒性T淋巴细胞及辅助性T细胞比值
所有含CPI的治疗均能显著增加具有效应表型（CD44+CD62L-）的细胞毒性T淋巴细胞比例，表明CPI能有效促进T细胞的功能分化。CpG联合CPI治疗则显著提升了效应细胞与初始细胞的比例，这更直接地反映了免疫系统向攻击状态的整体倾斜。
CpG联合CPI消除了冷冻消融诱导的PD-1上调，且冷冻消融联合CpG增强了PD-1/CTLA-4共表达
单独使用CpG或CPI能降低细胞毒性T淋巴细胞上PD-1的表达，但单独冷冻消融无此效果，甚至会抵消CpG或CPI的降低作用。然而，在三联疗法中，PD-1表达得以有效降低。此外，冷冻消融联合CpG治疗组细胞毒性T淋巴细胞上CTLA-4的表达以及PD-1/CTLA-4共表达水平较高，提示该组合可能引起了独特的免疫调节状态。
含CpG的治疗降低了调节性T细胞频率
调节性T细胞是免疫抑制的关键介质。分析发现，所有包含CpG的治疗方案都能显著降低肿瘤内调节性T细胞的频率。相反，单独的冷冻消融会提高卫星肿瘤中的调节性T细胞水平。这表明CpG在逆转调节性T细胞介导的免疫抑制中扮演核心角色。
无监督聚类揭示了不同治疗条件下独特的T细胞亚群动态
通过对T细胞进行无监督聚类分析，研究者发现了数个特征性亚群。例如，一个缺乏活化与检查点标志物的效应细胞毒性T淋巴细胞簇在CPI治疗组中富集，可能代表了被检查点抑制剂“释放”的、先前耗竭的T细胞。而冷冻消融联合CpG则富集了高度活化的细胞毒性T淋巴细胞簇。这些数据从单细胞水平揭示了不同疗法对T细胞状态的重编程。
CpG和CPI降低了冷冻消融治疗肿瘤中的髓源性抑制细胞水平；PD-1表达与髓源性抑制细胞频率呈正相关
髓源性抑制细胞是另一类重要的免疫抑制细胞。CpG或CPI单药能降低髓源性抑制细胞水平，但冷冻消融会抵消这种作用。在三联疗法中，髓源性抑制细胞水平得以降低。统计分析显示，细胞毒性T淋巴细胞上的PD-1表达水平与肿瘤内髓源性抑制细胞频率呈显著正相关，提示两者可能存在相互促进的免疫抑制环路。
循环与肿瘤浸润免疫细胞群之间的相关性及治疗诱导的外周血改变
外周血中的免疫细胞变化与肿瘤内的变化存在显著相关性，例如总细胞毒性T淋巴细胞频率和效应/初始细胞比值。这提示治疗引发了系统性的免疫应答。CpG联合CPI治疗在外周血中也表现出最高的效应/初始T细胞比值。
血浆细胞因子水平随时间变化
细胞因子分析显示，所有CpG治疗组在治疗后早期（第2天）血浆IL-10和TNF-α水平升高。而冷冻消融组在治疗后一周表现出更高的GM-CSF和IL-6水平，这两种细胞因子已知可促进髓源性抑制细胞的招募和扩增。
组织学分析揭示了CTL浸润在肿瘤各区域的不同模式
免疫组化结果证实，CPI能显著增加肿瘤内和肿瘤边缘的CD8+T细胞浸润。而单独的冷冻消融虽增加了肿瘤边缘的CD8+T细胞，但肿瘤内部的浸润减少，呈现出“免疫排斥”的表型。三联疗法则能有效促进CD8+T细胞在肿瘤内部的浸润。
在讨论与结论部分，本研究系统阐释了不同治疗组件的作用机制与协同价值。研究表明，单纯冷冻消融在破坏肿瘤、释放抗原的同时，也可能通过诱导GM-CSF、IL-6等细胞因子，促进髓源性抑制细胞扩增和调节性T细胞增多，从而创造一个系统性的免疫抑制环境，这解释了其为何会促进远端肿瘤生长。而CpG（TLR9激动剂）的核心作用在于重塑肿瘤微环境：增强抗原呈递、抑制调节性T细胞和髓源性抑制细胞。双免疫检查点抑制剂则主要负责解除T细胞的功能抑制，驱动细胞毒性T淋巴细胞的扩增和向效应状态分化。
将三者结合的三联疗法发挥了“取长补短”的协同效应。冷冻消融提供抗原来源；CpG将“冷”的免疫抑制微环境转化为“热”的免疫激活微环境，并削弱抑制性细胞；双CPI则解放被束缚的T细胞攻击力。这种组合成功将冷冻消融潜在的免疫抑制效应转化为强大的全身性抗肿瘤免疫，不仅控制了直接治疗的肿瘤，还通过“远端效应”抑制了未经处理的肿瘤，最终实现了生存期的显著延长。
该研究的重要意义在于，它为解决肝癌免疫治疗耐受的难题提供了一个具有转化潜力的多模式联合策略框架。它明确了冷冻消融、免疫佐剂和检查点抑制剂在抗肿瘤免疫环路中各自不可替代的角色及潜在的负面影响，为优化临床联合治疗方案提供了关键的临床前依据。目前，一项基于此策略的Phase 1临床试验（NCT06710233）正在开展，旨在评估对于晚期肝细胞癌患者，在进行部分冷冻消融并经肝动脉给予CpG（nelitolimod）后，再序贯使用双免疫检查点抑制剂STRIDE方案的安全性与耐受性。如果人体试验结果与小鼠研究一致，这种三联疗法有望超越当前STRIDE方案约20%的应答率，为肝细胞癌患者带来更持久、更有效的治疗新希望。
