《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Radiotherapy enhances M1 macrophage immunogenic activity through IFNs induction and stimulation in TP53-wild type tumors
编辑推荐：
为解决放疗的远端效应在何种肿瘤中最显著这一未解之谜，研究人员针对TP53野生型肿瘤开展了放疗增强免疫原性活性的机制研究。结果表明，放疗能特异性诱导TP53野生型肿瘤凋亡和干扰素(IFNs)表达，进而促进M1型巨噬细胞极化，增强免疫细胞活性。这为临床上筛选适合放疗联合免疫治疗的肿瘤类型提供了新依据。
当癌细胞在人体内肆意生长时，医生们手中的武器也在不断升级。从传统的化疗到精准的靶向治疗，再到近年来备受瞩目的免疫治疗，人类对抗癌症的策略日益丰富。免疫疗法，特别是免疫检查点抑制剂，旨在解除肿瘤对免疫系统的“刹车”，让患者自身的免疫细胞重新识别并攻击肿瘤。然而，现实并不总是如此理想。许多肿瘤内部宛如一座“冷”的堡垒——免疫细胞难以浸润，反而充斥着具有免疫抑制功能的细胞，如M2型巨噬细胞。这种“冷”肿瘤微环境是导致免疫疗法有效率仅在10%到30%徘徊的主要原因之一。
此时，一种历史悠久的肿瘤局部治疗手段——放射治疗（Radiotherapy, RT），因其潜在的“远端效应”而重新进入研究者的视野。所谓远端效应，是指对一处肿瘤进行放疗后，未受照射的远处肿瘤也出现缩小或抑制的现象。这暗示放疗不仅能直接杀伤肿瘤细胞，还可能像一支“穿云箭”，激活全身性的抗肿瘤免疫反应。研究表明，放疗可以诱导肿瘤细胞表达和释放干扰素（Interferons, IFNs），而干扰素是激活免疫系统、改善肿瘤微环境的关键信使。那么，一个关键的科学问题浮出水面：是否所有肿瘤在接受放疗后都能同样有效地激发这种免疫激活的“连锁反应”呢？答案很可能与一个被称为“基因组守护者”的基因——TP53有关。
TP53基因编码的p53蛋白，是细胞应对DNA损伤等压力的核心调控因子，能决定细胞是修复损伤还是走向凋亡。有趣的是，携带野生型TP53（未发生突变）的肿瘤对放疗更为敏感。既然放疗会造成DNA损伤，而野生型p53又能响应这种损伤，那么TP53野生型肿瘤是否正是那些最容易产生放疗远端效应、从而增强免疫治疗效果的“理想候选者”呢？发表在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上的这项研究，正是为了探索这一假说。研究团队结合生物信息学分析与细胞功能实验，深入探究了TP53状态如何决定放疗诱导的免疫原性激活，并揭示了其背后的关键机制——干扰素诱导与M1巨噬细胞极化。
为开展此项研究，作者运用了多项关键技术方法。首先，利用来自癌症基因组图谱（TCGA）等公共数据库进行生物信息学分析，探究TP53表达与免疫治疗相关基因的关联性及放疗相关基因与患者预后的关系。其次，研究采用了RNA测序（RNAseq）技术，对比分析了经干扰素γ（IFNγ）处理和经8 Gy X射线照射后的人肺癌A549细胞（TP53野生型）的差异表达基因谱。在细胞功能验证方面，研究使用了定量聚合酶链反应（qPCR）来检测基因表达变化，并通过流式细胞术检测细胞凋亡（采用Annexin V染色）以及免疫细胞活化标志物（如CD107a）。此外，研究还建立了体外共培养体系，将健康捐赠者外周血单个核细胞（PBMCs）与经过不同处理的肿瘤细胞共培养，以评估放疗对免疫细胞活化和巨噬细胞极化的影响。研究所用细胞系包括TP53野生型的A549（肺癌）、HepG2（肝癌）、HCT116（结肠癌）以及TP53敲除（TP53null）的HCT116细胞和TP53突变的PLC5（肝癌）细胞，通过对比明确TP53状态的作用。
研究结果部分揭示了多项重要发现：
TP53表达在TP53突变率较低的肝细胞癌中与免疫治疗基因高度相关
通过对肝细胞癌（LIHC）和肺腺癌（LUAD）数据库的分析，研究人员发现，在TP53突变率较低（约27%突变，73%为野生型）的LIHC中，p53的表达与15个选定的免疫治疗相关基因（如CD8、PD-L1、IFNG等）呈显著正相关。而在TP53突变率较高（约56%）的LUAD中，这种广泛的相关性则不明显。这提示在TP53野生型比例较高的癌症类型中，p53可能与积极的免疫微环境存在关联。
干扰素介导的基因表达与免疫治疗疗效正相关
RNAseq分析发现，IFNγ处理能显著上调A549细胞中75个基因的表达。其中，ICAM1、IRF1等top基因的表达，在公开的临床数据中与接受免疫治疗的患者更好的生存率相关。体外实验进一步证实，IFNα和IFNγ联合处理能显著提升与肿瘤细胞共培养的外周血单个核细胞（PBMCs）中免疫细胞的活化标志物（CD107a、IFNG、GZMB）以及M1型巨噬细胞标志物（TNFα、CXCL10）的表达，同时降低M2型标志物（ARG1）的表达。这明确了干扰素在激活免疫、促进M1极化中的核心作用。
放疗激活免疫细胞，但其调控的基因谱与干扰素处理截然不同
在TP53野生型A549细胞中，放疗（尤其≥4 Gy）能剂量依赖性地诱导p53下游基因（CDKN1A、MDM2）表达，并抑制肿瘤增殖标志物MKI67，同时诱导IFNα和IFNG的表达。将放疗后的A549细胞与PBMCs共培养，能同样激活免疫细胞并促进M1极化。然而，RNAseq分析揭示了一个关键现象：放疗（8 Gy）诱导的88个上调基因与IFNγ诱导的75个上调基因完全没有重叠。通路分析显示，IFNγ相关基因富集在STAT信号通路，而放疗相关基因则富集在p53信号通路。这表明，虽然放疗能诱导干扰素产生，但其对肿瘤细胞本身的直接转录调控主要通过p53通路实现，与单纯外源性干扰素刺激的路径不同。
放疗介导的肿瘤凋亡和基因表达主要依赖于TP53通路
功能实验直接证实了p53的核心地位。放疗能显著诱导TP53野生型A549和HCT116细胞凋亡，但对TP53null的HCT116细胞作用微弱。同样，放疗（或p53激活剂Nutlin-3a）调控的一系列基因（如上调MDM2、下调MKI67等）的表达变化，在TP53野生型细胞中非常明显，而在TP53null细胞中则基本消失。在肝癌细胞中也观察到类似现象：放疗能同时诱导细胞周期阻滞标志物CDKN1A和凋亡标志物BBC3，并抑制MKI67，但仅发生在TP53野生型的HepG2细胞中，而在TP53突变的PLC5细胞中无效。
放疗诱导的干扰素表达特异性地源于TP53野生型肿瘤，并促进免疫原性活化和M1极化
这是本研究最核心的发现之一。qPCR检测显示，放疗（≥4 Gy）能显著诱导TP53野生型HepG2和HCT116细胞表达IFNα和IFNG，但在TP53突变型PLC5和TP53null HCT116细胞中则无法诱导。尽管处于应激状态的放疗后肿瘤细胞自身对干扰素刺激的反应（如PD-L1上调）减弱，但其培养上清却能激活未受照射的肿瘤细胞。更重要的是，共培养实验表明，只有与放疗后的TP53野生型HCT116细胞共培养，PBMCs中的CD4+T细胞、CD8+T细胞等免疫细胞的活化标志物CD107a才会显著升高，并且M1型巨噬细胞标志物（TNFα、CXCL10）上调，M2型标志物（ARG1、IL-10）下调。而与放疗后的TP53null HCT116细胞共培养则无此效果。这证明，放疗所激发的免疫细胞活化和M1极化，确实特异性地依赖于TP53野生型肿瘤所产生的干扰素。
在讨论与结论部分，研究者整合上述结果，提出了一个机制模型（如图6所示）。在TP53野生型肿瘤中，放疗造成的DNA双链断裂一方面通过激活ATM-p53通路，导致细胞周期阻滞（CDKN1A表达）和凋亡；另一方面，产生的DNA片段会激活cGAS-STING通路，诱导I型干扰素的表达和释放。这些干扰素作为关键信使，激活肿瘤微环境中的免疫细胞，特别是促进巨噬细胞向抗肿瘤的M1表型极化。M1巨噬细胞又能进一步释放CXCL9、CXCL10等趋化因子，招募更多T细胞，从而将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤，为联合免疫治疗创造有利条件。相反，在TP53突变型肿瘤中，放疗主要激活ATM介导的DNA修复通路，促进细胞存活，且突变p53可能抑制cGAS-STING通路，导致干扰素产生缺失，免疫细胞无法被有效激活，甚至因免疫检查点表达而耗竭。
综上所述，本研究首次在机制层面将肿瘤的TP53基因状态、放疗的远端免疫效应以及巨噬细胞极化三者联系起来。其重要意义在于：它不仅解释了为何放疗的免疫增强效果存在肿瘤异质性，更重要的是为临床精准治疗提供了潜在的生物标志物。研究结果表明，TP53野生型肿瘤可能是放疗联合免疫治疗（如PD-1/PD-L1抑制剂）的“理想候选者”。在临床实践中，通过检测肿瘤的TP53状态，或许能更有效地筛选出更可能从这种联合疗法中获益的患者群体，从而实现肿瘤免疫治疗的精准化，提高治疗成功率，具有重要的转化医学价值。当然，研究者也指出，目前结论主要基于体外细胞实验，其机制假说有待后续动物模型及临床研究的进一步验证。
