《Cell and Tissue Research》：The relationship between Connexin 43 (Cx43) and partner protein, human discs large homologue-1 (Dlg1) during wound closure in keratinocytes
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本刊推荐：慢性难愈合伤口是临床治疗难题，其机制与细胞间通讯蛋白Cx43的表达失调密切相关。本文聚焦于角质形成细胞伤口愈合过程，深入探究了Cx43与其支架蛋白伴侣Dlg1之间的功能互作。研究发现，Dlg1通过与Cx43相互作用，正向调控细胞增殖，从而影响伤口闭合速率。这为理解正常伤口愈合及慢性伤口形成的细胞机制提供了新见解，并提示Dlg1可能是促进伤口愈合的潜在新靶点。
慢性伤口是影响全球数百万患者生活质量的一大难题，其治疗往往困难且昂贵。在皮肤这类上皮组织中，细胞并不是孤立的个体，它们通过一种叫做间隙连接（Gap Junction）的通道结构进行直接“对话”，交换离子、代谢物甚至微小RNA。连接蛋白43（Connexin 43, Cx43）是形成这些细胞间通讯通道的关键蛋白。有趣的是，在正常伤口愈合的早期，伤口边缘细胞的Cx43会从细胞膜上“撤退”到细胞质中，这种暂时性的减少被认为有利于细胞迁移以快速覆盖伤口。然而，在糖尿病足溃疡等慢性难愈合伤口中，Cx43在伤口边缘却持续高表达，这似乎阻碍了愈合进程。因此，理解Cx43在细胞膜上的定位、稳定与降解如何被调控，是解开伤口愈合分子机制的关键一环。此前研究表明，一种名为Dlg1（人类Discs Large同源蛋白-1）的膜相关鸟苷酸激酶（MAGUK）家族蛋白能与Cx43直接结合，并将Cx43“锚定”在细胞膜上，防止其被降解。基于此，一个核心科学问题被提出：在角质形成细胞的伤口愈合过程中，Cx43的伙伴蛋白Dlg1是否也参与其中，并扮演着重要角色？这项发表在《Cell and Tissue Research》上的研究，正是为了解答这一问题。
为了探究Cx43与Dlg1在伤口愈合中的动态关系，研究人员综合利用了多种技术手段。主要研究方法包括：利用AlphaFold3人工智能模型预测两种蛋白C端结构域的互作界面；使用人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）构建体外划痕（Scratch Wound）伤口模型；通过siRNA（小干扰RNA）敲低Dlg1来研究其功能；运用免疫荧光共聚焦显微镜和活细胞成像技术观察蛋白在伤口愈合过程中的亚细胞定位变化；利用蛋白质印迹（Western Blot）分析蛋白水平随时间的变化；并采用Incucyte活细胞分析系统结合丝裂霉素C（Mitomycin C）处理，精确区分细胞增殖和迁移在伤口闭合中的贡献。
AlphaFold3建模揭示了Cx43与Dlg1 C端之间的三个潜在相互作用位点
研究人员首先使用AlphaFold3对Cx43和Dlg1的C端结构域进行复合物结构建模。模型预测了三个主要的相互作用区域：位点A（Cx43的263–269位氨基酸）与Dlg1的SH3和HOOK结构域相互作用；位点B（Cx43的283–288位氨基酸）与Dlg1的HOOK结构域作用；位点C（Cx43的302–320位氨基酸）与Dlg1的GUK结构域作用。其中位点A和C的预测置信度较高。值得注意的是，这些相互作用位点不涉及Cx43 C末端的最后四个氨基酸，这与Cx43的另一个关键互作蛋白ZO-1的结合位点不同，提示Dlg1与Cx43的相互作用模式是独特的。
Dlg1在伤口闭合过程中与Cx43在角质形成细胞内共定位
在HaCaT细胞划痕实验中，免疫荧光染色显示，在未受伤的对照细胞和划痕后0小时，Cx43和Dlg1主要共定位于细胞膜上。划痕后4小时，伤口边缘细胞的Cx43从膜上明显减少，弥散在细胞质中，而Dlg1部分保留在膜上，部分也进入细胞质并与Cx43共定位。到8小时和16小时，Cx43开始重新在膜上形成斑块，而Dlg1则表现出更多的胞质定位。至24小时伤口基本闭合时，两种蛋白再次主要共定位于细胞膜。共定位定量分析显示，在划痕后16小时，Cx43与Dlg1的共定位水平显著下降。同时，蛋白质印迹分析表明，在划痕后4小时和8小时，Cx43和Dlg1的蛋白水平均有下降，而在16小时后Cx43水平显著回升。这些结果表明，在伤口愈合过程中，Cx43和Dlg1均发生了从膜到胞质的再定位，且Dlg1的动态变化可能滞后于Cx43。
Cx43和Dlg1在活细胞实验的伤口愈合过程中于细胞突起内共定位
在表达荧光标记蛋白（Cx43-mCherry和Dlg1-GFP）的HEK293细胞中进行活细胞成像观察发现，在向伤口边缘迁移的细胞中，两种蛋白主要在细胞质中共定位。更重要的是，在细胞伸出伪足样结构时，Cx43首先进入这些突起，随后Dlg1也进入并与Cx43共定位，提示二者可能在细胞迁移前沿的动态结构重组中协同作用。
敲低Dlg1会抑制HaCaT细胞的伤口愈合
功能实验发现，使用siRNA敲低Dlg1（效率约73%，并导致Cx43水平降低约40%）的HaCaT细胞，其划痕伤口的相对愈合密度（RWD%）在12至24小时显著低于对照组细胞。作为阳性对照，使用Cx43模拟肽AnGap27处理则能促进伤口闭合。这表明Dlg1对于角质形成细胞的有效伤口闭合是必需的。
敲低Dlg1抑制HaCaT细胞的增殖，而非迁移
为了区分Dlg1影响伤口愈合的具体细胞行为，研究人员进行了细胞增殖和迁移分析。MTT实验和Incucyte细胞汇合度检测均表明，敲低Dlg1显著降低了HaCaT细胞的代谢活性和增殖能力。随后，在使用丝裂霉素C抑制细胞增殖后，再次进行划痕实验。结果显示，在增殖被抑制的条件下，敲低Dlg1组与对照组的伤口闭合速率没有显著差异。这表明，Dlg1主要通过调控细胞增殖，而非细胞迁移，来影响伤口的闭合速率。
本研究通过一系列实验，揭示了在角质形成细胞伤口愈合过程中，Cx43与其互作蛋白Dlg1之间复杂的动态关系。AlphaFold3建模为两者的物理互作提供了精细的结构预测。细胞生物学实验证实，在愈合过程中，二者协同地从细胞膜向细胞质转移，并可能在迁移细胞的伪足中共同发挥作用。最关键的功能学证据表明，Dlg1是伤口高效闭合所必需的，其机制主要在于促进细胞增殖，而非直接影响细胞迁移。这一发现将Dlg1的作用与已知的Cx43调控因子ZO-1区分开来，拓展了我们对间隙连接蛋白在伤口愈合中调控网络的理解。研究结果表明，Dlg1除了已知的维持Cx43在膜上稳定的功能外，在伤口愈合的特定阶段还具有独立于Cx43的关键作用。这为未来开发针对Dlg1-Cx43轴的新型促愈合疗法提供了理论基础和潜在靶点。
