Heterobifunctional proteomimetic polymers for targeted degradation of MYC and KRAS

《Nature Communications》：Heterobifunctional proteomimetic polymers for targeted degradation of MYC and KRAS

靶向蛋白降解（TPD）是调控“不可成药”靶点的新兴策略，但传统小分子PROTACs设计复杂、靶点范围受限。研究人员开发了名为HYDRAC的杂交降解除聚物平台，通过聚合物主链偶联靶向肽和降解肽，实现了对MYC和KRAS的高效、选择性降解，为攻克传统“不可成药”癌蛋白提供了通用、可扩展的新范式。

　　

在癌症研究和治疗领域，一些关键的驱动蛋白，如MYC和KRAS，长期以来被认为是“不可成药”（undruggable）的靶点。它们缺乏传统小分子药物可结合的口袋，或者其功能依赖于难以被直接抑制的蛋白质-蛋白质相互作用。靶向蛋白降解技术，特别是PROTACs（PROteolysis Targeting Chimeras，蛋白降解靶向嵌合体）的出现，为这类靶点带来了曙光。PROTACs是一种异双功能分子，一端结合靶蛋白，另一端招募E3泛素连接酶，从而将靶蛋白泛素化并引导至蛋白酶体降解。然而，小分子PROTACs的开发高度依赖于寻找能与靶点高亲和力结合的小分子配体，这个过程漫长且充满挑战，并且其结构通常仅限于两到三个功能域，限制了其设计和优化的空间。因此，亟需一种更通用、模块化、可快速适配不同靶点的平台技术。

为了解决这一难题，研究人员构想并开发了一种名为HYDRAC（HYbrid DegRAding Copolymer，杂交降解除聚物）的蛋白模拟聚合物平台。它借鉴了小分子PROTACs的“诱导接近”核心逻辑，但采用了完全不同的分子骨架。HYDRAC本质上是基于肽刷共聚物的统计异双功能共聚物，其聚合物主链上通过“接枝聚合”方法，以统计方式共价连接了两种功能侧链：一种是靶向结合肽（如结合MYC的H1肽段），另一种是降解子（degron），可以是短肽（如RRRG）或是招募E3连接酶的小分子（如沙利度胺，thalidomide）。这种设计带来了多重优势：合成方法可扩展、结构高度可调、支持多价有效负载连接，并且其固有的模块性允许整合多样化的靶点结合基序和E3连接酶招募模块。

这项发表在《自然·通讯》（Nature Communications）上的研究，成功地证明了HYDRAC平台的有效性。研究人员首先针对公认难靶向的癌蛋白MYC（Myelocytomatosis proto-oncogene）进行概念验证。他们选择了源自MYC蛋白bHLH-LZ（basic helix-loop-helix/leucine zipper，碱性螺旋-环-螺旋/亮氨酸拉链）结构域的一个已验证的抑制性肽（H1: NELKRAFAALRDQI）作为靶向“弹头”，与一个已知能引发蛋白酶体介导降解的四肽降解子（RRRG）共聚，合成了MYC靶向的HYDRAC。体外实验证实，这种聚合物能稳定结合MYC，有效进入细胞，并在多种癌细胞系中引发MYC蛋白的特异性降解，同时下调MYC靶基因的转录程序。重要的是，这种降解作用依赖于蛋白酶体和泛素化通路，并且呈现出催化模式——一个HYDRAC分子可以循环使用，降解多个MYC蛋白分子。体内实验进一步显示，注射HYDRAC能有效抑制小鼠模型中MYC驱动的肿瘤生长。

为了展示平台的通用性，研究人员进一步将其应用于另一个著名的“不可成药”靶点KRAS（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）。他们使用一个源自RAF-1的共识RAS结合序列作为靶向肽，同样与RRRG或其他E3连接酶招募模块（如VHL、CRBN配体）结合，构建了RAS靶向的HYDRAC。实验表明，这些聚合物能够有效降解携带不同KRAS突变（如G12V, G12D）的癌细胞中的KRAS蛋白，显示了其作为泛KRAS降解剂的潜力。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：1. 可控开环复分解聚合：用于合成具有精确聚合度和低分散性的肽刷共聚物。2. 圆二色光谱：用于分析聚合物与靶蛋白（如MYC的bHLH-LZ结构域）的相互作用和构象变化。3. 小角X射线散射：表征聚合物在水溶液中的三维折叠形态，证实其形成类似天然蛋白的球形结构。4. 体外与体内药效学评估：包括细胞活力测定、Western blot蛋白检测、流式细胞术分析细胞凋亡、RNA测序分析转录组变化，以及在小鼠异种移植模型中进行抗肿瘤疗效和生物分布研究。5. 基于串联质谱标签的定量蛋白质组学：用于全局性、无偏地评估HYDRAC处理后细胞蛋白质组的变化，验证其靶向选择性。6. 基因敲除和化学抑制剂验证：利用VHL或KEAP1基因敲除细胞系，以及CRBN竞争性抑制剂波马度胺，验证降解通路的特异性。

研究结果：

HYDRACs containing MYC inhibitory peptide H1 stably bind MYC（含有MYC抑制肽H1的HYDRACs能稳定结合MYC）：研究人员设计并合成了包含MYC靶向肽H1和降解子RRRG的统计共聚物HYDRAC，以及一系列对照聚合物。小角X射线散射显示HYDRACs在水中折叠成类似蛋白质的球形结构，增强了其对蛋白酶降解的抵抗能力。圆二色光谱和生物素下拉实验证实，HYDRACs能特异性、稳定地与MYC蛋白结合。

MYC HYDRACs are cell-penetrant and disrupt target-driven transcriptional programs（MYC HYDRACs具有细胞渗透性并能破坏靶标驱动的转录程序）：流式细胞术和共聚焦显微镜显示，荧光标记的HYDRACs能通过内吞途径高效进入癌细胞。RNA测序分析表明，HYDRAC处理能特异性下调MYC靶基因集合，其转录组变化与MYC敲低（siRNA）所引起的变化不同，提示降解机制带来了独特的生物学效应。

Cellular toxicity is dependent on both side chain composition and the presence of functional MYC protein（细胞毒性取决于侧链组成和功能性MYC蛋白的存在）：细胞活力实验显示，HYDRACs对MYC依赖的癌细胞（如PC3、A549）具有显著毒性（IC₅₀值在微摩尔级别），其活性依赖于靶向肽和降解子的共价连接。在缺乏MYC二聚化伙伴MAX的PC12细胞中，HYDRACs毒性大大降低，证明了其作用依赖于功能性MYC信号通路。单次给药后，HYDRACs能持续抑制细胞增殖达两周，显示了其长效作用潜力。

HYDRACs selectively degrade their target in a catalytic manner（HYDRACs以催化方式选择性降解其靶标）：Western blot分析证实，HYDRACs能在低微摩尔浓度下剂量依赖性地降低MYC蛋白水平，而单独的靶向肽聚合物（P-H）或降解子聚合物（P-R），或两者的混合物均无此效果。这种降解不依赖于MYC mRNA水平的变化。在移除HYDRAC后，MYC蛋白水平的抑制仍能持续，表明其作用具有催化特性。使用蛋白酶体抑制剂MG132或neddylation（类泛素化修饰）抑制剂MLN4924处理，可以挽救MYC蛋白水平，证明降解依赖于泛素-蛋白酶体系统和Cullin-RING E3连接酶的活性。此外，HYDRACs能降解不受内源性磷酸化调控的MYC^T58A突变体，表明其绕过了内源性降解通路。

Whole proteome analyses demonstrate HYDRAC-induced protein changes are selectively on-target（全蛋白质组分析表明HYDRAC诱导的蛋白质变化具有选择性靶向性）：基于串联质谱标签的定量蛋白质组学分析显示，与对照聚合物P-H处理相比，HYDRAC处理导致MYC蛋白显著下调，而其他蛋白质，包括整个bHLH转录因子家族的其他成员，均未发生显著变化，证明了HYDRACs极高的靶向选择性。

MYC HYDRACs localize to the tumor and inhibit tumor growth（MYC HYDRACs在肿瘤中富集并抑制肿瘤生长）：在小鼠肿瘤模型中，静脉注射Cy5.5标记的HYDRACs显示其在肿瘤部位持续积累长达72小时。在MYCCap同种移植瘤模型中，腹腔注射HYDRACs能显著抑制肿瘤生长，并增加肿瘤组织中的细胞凋亡标志物cleaved caspase-3水平，同时降低增殖标志物Ki67水平，且未引起明显的体重下降。

HYDRACs incorporating diverse E3 ligase recruiters elicit target degradation dictated by sidechain identity（整合不同E3连接酶招募模块的HYDRACs能引发由侧链身份决定的靶标降解）：研究人员证明了HYDRAC平台的模块化特性。他们将RRRG降解子替换为其他已知的E3连接酶招募模块，包括肽类配体（用于VHL和KEAP1）和小分子配体沙利度胺（用于CRBN），合成了多种MYC靶向HYDRAC变体。实验表明，所有这些变体均能有效降解MYC。通过使用基因敲除细胞系（VHL KO, KEAP1 KO）或竞争性小分子抑制剂（波马度胺），确认了每种HYDRAC变体的降解作用都特异性地依赖于其对应的E3连接酶通路。

HYDRACs can be generalized to degrade a second target, RAS（HYDRACs可推广用于降解第二个靶标RAS）：为了验证平台的通用性，研究人员构建了靶向KRAS的HYDRACs，使用了源自RAF-1的RAS结合序列作为靶向肽。这些RAS靶向的HYDRACs成功地在携带不同KRAS突变（G12V, G12D）的癌细胞系中诱导了KRAS蛋白的降解，表明该方法具有攻克多种难成药靶点的潜力。

结论与讨论：

本研究表明，HYDRACs代表了一类新型的异双功能蛋白降解剂，它巧妙地结合了聚合物化学的多价性、模块性和肽/小分子配体的特异性。与需要精确优化连接体长度的小分子PROTACs不同，HYDRACs的随机共聚物骨架天然包含了从相邻到全链长的多种域间距离，其柔性的三维球状构象允许“诱导拟合”，从而更灵活地促成靶蛋白与E3连接酶之间形成有效的三元复合物。这种设计使其能够规避传统小分子TPD技术的一些固有局限性。

研究成功地将HYDRACs应用于两个长期难以靶向的癌蛋白MYC和KRAS，实现了高效、选择性的降解，并在体外和体内模型中展现了抗肿瘤活性。更重要的是，平台展示了高度的模块化和“即插即用”能力，通过简单地更换靶向肽和降解子模块，即可快速构建针对不同靶点和降解通路的降解剂。

这项工作不仅为MYC和KRAS等“不可成药”靶点提供了新的治疗策略，更重要的是，它提出了一个通用的、可扩展的平台技术。HYDRAC平台有望被快速应用于其他疾病相关蛋白，包括神经退行性疾病（如阿尔茨海默症中的淀粉样蛋白β）、炎症性疾病和心血管疾病等领域的靶点，从而极大地扩展靶向蛋白降解的治疗武器库，并为化学生物学研究提供强大的新型探针工具。