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为应对菌丝基材料在机械强度和耐用性方面的局限性，研究人员聚焦于白腐真菌的关键转录因子mbp1，通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术构建了二倍体mbp1缺陷菌株。研究发现，mbp1的缺失改变了菌丝体的细胞壁组成与密度，从而显著提高了菌丝垫的杨氏模量和极限拉伸强度，并增强了菌丝基复合材料的压缩强度。这项研究为通过分子育种定向改良可持续生物材料的性能提供了首个范例，具有重要的理论和应用价值。
随着可持续发展理念的深入人心，利用真菌菌丝体与农业、林业残余物结合生产的菌丝基材料，正因其生物可降解性和低环境影响，成为传统材料极具潜力的绿色替代品。从菌丝垫衍生的皮革替代品、弹性体，到菌丝体渗透并粘结基材形成的包装和建筑材料，这些生物基材料展示出广阔的应用前景。其中，白腐真菌糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus，又称食用平菇）因其公认的安全性（GRAS status）和可生产出轻质、高比强度复合材料的特性，成为该领域研究和应用的热点菌株。然而，与现有的工业产品相比，菌丝基材料在最大机械强度和耐用性方面仍相对不足，这限制了其更广泛的实际应用。
为了攻克这些瓶颈，研究者们尝试了多种策略，包括从自然界筛选菌种、优化培养条件、以及利用化学试剂或紫外线/γ辐射诱变。近年来，能够直接操控特定菌丝性状的分子育种技术，特别是基因组编辑，被视为一种极具前景的改良途径。真菌的物理性质被认为与其细胞壁结构和菌丝密度密切相关。细胞壁主要由α-葡聚糖、β-葡聚糖、几丁质等多糖以及蛋白质构成。其中，几丁质和葡聚糖被认为是贡献机械强度的关键因素，而蛋白质则被预测为可增强延展性的塑化剂。此前已有研究表明，增加蛋白质和脂质的相对含量，同时降低几丁质的相对含量，可以增强菌丝的延展性。在另一项关于裂褶菌（Schizophyllum commune）的研究中，疏水蛋白编码基因sc3的敲除显著增加了菌丝密度，从而增强了菌丝垫的杨氏模量和最大拉伸强度。这些发现共同指向一个方向：通过分子育种靶向调控细胞壁结构和菌丝密度，是提升菌丝基材料性能、克服其应用挑战的潜在钥匙。
在此背景下，研究人员将目光投向了糙皮侧耳中的一个推定APSES家族转录因子Mbp1。先前的研究表明，单倍体mbp1缺陷菌株（Δmbp1）表现出菌丝生长速率降低和气生菌丝形成受损，并导致细胞壁变薄、β-葡聚糖相对比例降低以及几丁质合酶基因表达谱的改变，这些都表明mbp1在调控细胞壁合成中扮演着关键角色。然而，mbp1的缺失对菌丝基材料物理性能的具体影响仍不清楚。为了填补这一知识空白，并考虑到二倍体菌株生长更快、更适用于材料生产，本研究旨在评估mbp1敲除对二倍体糙皮侧耳菌株的菌丝垫和菌丝基复合材料性能的影响。
本研究主要运用了以下几个关键技术方法：1. 利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，构建了靶向mbp1基因的向导RNA（sgRNA）质粒，并转化糙皮侧耳野生型菌株#61，成功获得了mbp1基因发生移码突变的单倍体缺陷菌株。2. 通过菌株杂交，将单倍体野生型与缺陷型菌株配对，构建了用于后续材料生产的二倍体对照菌株（20b×#61）和mbp1缺陷菌株（Δmbp1#2×mbp1g2#1和Δmbp1#4×mbp1g2#1）。3. 建立了标准的菌丝垫和菌丝基复合材料的生产与制备流程，并对材料进行了系统的物理性能（拉伸、压缩测试）和化学性质（葡聚糖、几丁质含量测定，傅里叶变换红外光谱ATR-FTIR分析）表征。
结果部分：
Isolation of P. ostreatus dikaryon strains (糙皮侧耳二倍体菌株的分离)
研究人员利用CRISPR/Cas9系统在野生型亲本菌株#61中成功敲除了mbp1基因，并通过杂交获得了二倍体mbp1缺陷菌株及其对照菌株。与对照菌株20b×#61相比，二倍体mbp1缺陷菌株的菌丝生长速率降低了约19%，并且β-葡聚糖的相对百分比显著降低，而α-葡聚糖和几丁质的相对百分比则无显著差异。此外，对照菌株能在约7天内形成子实体，而两种二倍体mbp1缺陷菌株在30天的诱导期内均未形成任何原基或子实体，表明mbp1的破坏损害了子实体的形成能力。
mbp1 disruption affects the physical properties of mycelium mats (mbp1敲除影响菌丝垫的物理特性)
通过拉伸测试评估菌丝垫的物理性能发现，二倍体mbp1缺陷菌株生产的菌丝垫，其杨氏模量（约1385 MPa和1304 MPa）和极限拉伸强度（约11.8 MPa）均显著高于对照菌株20b×#61（分别为1029 MPa和7.9 MPa），表明菌丝垫变得更硬、更强。然而，在断裂伸长率和断裂能方面未观察到显著差异。值得注意的是，缺陷菌株的菌丝垫上出现了对照菌株所没有的黑斑。
mbp1 disruption enhanced the performance of mycelium-based composites (mbp1敲除提升了菌丝基复合材料的性能)
在外观无明显差异的情况下，对菌丝基复合材料进行的压缩测试显示，二倍体mbp1缺陷菌株所制复合材料的压缩强度（约0.73 MPa）显著高于对照菌株（0.58 MPa）。这表明mbp1的敲除同样增强了菌丝基复合材料的机械强度。
对菌丝垫密度与化学性质的分析
进一步分析发现，二倍体mbp1缺陷菌株的菌丝垫比对照菌株的更薄，但重量无显著差异，从而导致其菌丝密度显著高于对照。扫描电镜观察未发现明显的菌丝形态差异。ATR-FTIR分析则表明，缺陷菌株菌丝垫中代表蛋白质的N-H弯曲/C-N伸缩（1530 cm-1）和C=O伸缩（1625 cm-1）峰与代表多糖的C-O-C伸缩（1020 cm-1）峰的比值均降至对照菌株的一半左右，这表明mbp1敲除降低了蛋白质相对于多糖的相对丰度。
研究结论与讨论：
本研究得出结论，在糙皮侧耳中敲除转录因子mbp1基因，能够有效改善菌丝基材料的性能。这是首个证实分子育种技术可以提升菌丝基复合材料性能的研究。
讨论部分深入分析了其内在机制。首先，菌丝垫密度与杨氏模量之间存在强正相关（R2= 0.80），表明物理特性的改变很大程度上归因于菌丝密度的增加。mbp1缺陷菌株形成气生菌丝的能力下降，导致菌丝垫更薄但更致密，这种高密度结构直接贡献了更高的机械刚度。这与之前在裂褶菌中敲除疏水蛋白基因sc3的研究结论一致。其次，细胞壁化学成分的变化也起到重要作用。FT-IR分析显示缺陷菌株中蛋白质与多糖的比例下降。由于蛋白质充当增强延展性的塑化剂，而多糖是提供机械强度的关键，这种蛋白质相对含量的减少可能进一步促使菌丝垫变硬。因此，菌丝密度和细胞壁组成的共同改变，决定了菌丝垫物理特性的提升。至于菌丝垫上出现的黑斑，其成因尚不清楚，但可排除是污染所致，有待未来研究。
这种性能提升也延伸至菌丝基复合材料。尽管外观无差异，但缺陷菌株产生的更致密、更强健的菌丝网络，增强了复合材料内部的结合力，从而提高了其压缩强度。菌丝垫中观察到的菌丝密度和细胞壁化学组成的变化，预计会影响复合材料的物理特性，但具体是哪些因素起主导作用仍需进一步探究。
此外，mbp1缺陷菌株完全丧失了形成子实体的能力。鉴于子实体发育涉及复杂的细胞壁合成与降解的重塑过程，Mbp1可能在此过程中对细胞壁代谢的正常调控至关重要。从材料生产的角度看，抑制子实体发育被认为是一种提高菌丝基材料生产稳定性和效率的经济策略，因此mbp1缺陷菌株的这一特性可能反而有利于实际应用。
综上所述，这项发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上的研究，通过精准的分子育种操作，首次实现了对食用真菌来源的菌丝基材料性能的定向增强。它不仅揭示了转录因子Mbp1在调控糙皮侧耳菌丝生长、细胞壁合成及材料力学性能中的关键作用，更重要的是，为未来通过基因工程手段理性设计并优化可持续生物材料提供了全新的思路和坚实的技术范例，有望推动菌丝基材料在包装、建材、纺织乃至人造肉等更广泛领域的应用。
