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为应对传统微生物技术成本高和“塑料危机”的挑战，本研究聚焦于嗜热菌Caldimonas thermodepolymerans（卡氏嗜热解聚菌）作为下一代工业生物技术（NGIB）底盘的应用潜力。研究团队系统评估了该菌对木糖、葡萄糖、纤维二糖等植物源糖类的利用偏好，发现其葡萄糖代谢存在转运瓶颈，并成功通过引入运动发酵单胞菌的glf葡萄糖转运蛋白基因，显著提升了工程菌株（Cald_GLF3）对葡萄糖的利用效率和聚羟基丁酸酯（PHB）的产量，尤其是在纤维二糖底物上。该研究证明了靶向代谢工程对于释放嗜热菌生物技术潜力的关键作用，为利用木质纤维素资源可持续生产生物塑料提供了新的高效平台。
在当今世界，化学工业正面临着一场深刻的变革：从依赖不可再生的化石资源转向利用可再生的生物质资源。与此同时，全球每年产生超过3.5亿吨的塑料废弃物，其整个生命周期与每年约20亿吨二氧化碳当量的温室气体排放相关，对生态系统构成严重威胁。因此，开发环境友好、可生物降解的塑料替代品迫在眉睫。微生物合成的聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates， PHA）正是这样一类具有潜力的生物聚酯，它们可在多种有生物活性的条件下被快速降解，是传统石油基塑料的理想替代品。
然而，传统的微生物发酵技术存在投资和运营成本高、易受杂菌污染等问题。为了克服这些瓶颈，科学家提出了“下一代工业生物技术”（Next-Generation Industrial Biotechnology， NGIB）的概念，其核心是利用极端微生物（如嗜热菌、嗜盐菌）作为生物制造的底盘。这些微生物天生对极端条件（如高温、高盐）具有耐受性，从而赋予生产过程天然的鲁棒性，简化上下游工艺。其中，中度嗜热菌Caldimonas thermodepolymeransDSM 15344（曾用名Schlegelella thermodepolymerans）因能够利用木质纤维素来源的糖类生产PHA而崭露头角，成为一个有前景的NGIB候选者。
虽然已知C. thermodepolymerans偏好利用木糖，但其对多种植物源糖类及其混合物的全面代谢潜力，尤其是对葡萄糖利用效率低下的根本原因，尚不清楚。是细胞内代谢通路不通畅，还是“大门”（即糖转运系统）出了问题？这个问题对于充分挖掘该菌作为生物制造平台的潜力至关重要。因此，本研究旨在系统评估C. thermodepolymerans利用多种糖类生产PHA的能力，并探究其葡萄糖代谢的瓶颈所在，进而通过代谢工程手段对其进行改造。
研究人员采用了多种关键技术方法展开研究。首先，他们利用12孔板和摇瓶培养系统，对包括木糖、葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖、木二糖、麦芽糖和麦芽三糖在内的多种植物源糖类进行了系统的代谢潜能筛选和利用动力学分析，监测细胞生长、PHA积累和底物消耗。其次，为了探究并解决葡萄糖利用的瓶颈，研究团队采用了基因工程技术，将来自中温细菌Zymomonas mobilis（运动发酵单胞菌）的葡萄糖协助扩散蛋白基因glf，通过基于mini-Tn5转座子的载体pBAMD1-6随机整合到C. thermodepolymerans的基因组中，从而构建了工程菌株Cald_GLF3。最后，研究使用气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）分析PHA含量和组成，并使用高效液相色谱（HPLC）监测培养液中糖类的浓度变化。
研究结果
木质纤维素相关糖类的利用
筛选实验表明，C. thermodepolymerans在测试的单糖中明显偏好木糖，而对葡萄糖的利用效率较低。有趣的是，该菌对由β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖寡聚物（如纤维二糖和纤维三糖）的利用表现出极高的效率，其生长和聚羟基丁酸酯（PHB）合成甚至优于在木糖上的表现。相反，对于由α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖和麦芽三糖，其利用能力非常有限。
木糖、葡萄糖和纤维二糖的利用动力学
摇瓶培养的动力学研究证实了木糖优于葡萄糖。在葡萄糖上培养时，菌体经历了长达36小时的延滞期。在所有测试糖中，纤维二糖是最受偏好的底物，支持了最高的细胞干重（CDW）和PHB滴度。然而，在培养过程中，培养基中检测到了葡萄糖的积累，表明部分纤维二糖在细胞外被水解成了葡萄糖。由于野生型菌株代谢葡萄糖的效率低下，这些被“泄露”出来的葡萄糖在培养基中积累，最终制约了整个系统的生产效率。
糖混合物上的生长、PHB生产和糖利用动力学
在糖混合物（二元和三元）上培养时，总体的培养效率和PHB积累通常低于单一糖类（如木糖或纤维二糖）。当葡萄糖与木糖混合时，木糖被优先且快速地消耗，而葡萄糖利用率低，约一半剩余。在木糖和纤维二糖的混合物中，纤维二糖的消耗速率很高，但其细胞外水解产生的葡萄糖却未被有效利用，影响了PHB产量。葡萄糖与纤维二糖的组合效率最低。值得注意的是，在三元混合物（木糖、葡萄糖、纤维二糖）中，PHB产量显著高于二元混合物，且最终残留的葡萄糖浓度很低。
外源葡萄糖转运蛋白的整合
为了验证葡萄糖转运是主要瓶颈的假设，研究人员将Z. mobilis的glf基因整合到C. thermodepolymerans的基因组中。由于Glf蛋白的热不稳定性，工程菌株Cald_GLF3需要在42°C（低于该菌最适生长温度50°C）下培养。结果表明，Cald_GLF3在木糖上的生长和PHB生产能力与野生型无异，但在葡萄糖上的能力得到显著改善，消除了延滞期，PHB滴度与在木糖上相当。更重要的是，Cald_GLF3在纤维二糖上表现出了惊人的生产能力，达到了目前摇瓶培养中最高的CDW（11.5 g/L）和PHB滴度（9.6 g/L）。在含有纤维二糖的糖混合物中，工程菌株也表现出比野生型更高的PHB生产率。
讨论与结论
本研究的发现与之前的研究一致，确认了C. thermodepolymerans高效利用木糖和纤维二糖的能力。其对纤维二糖和纤维三糖的偏好可能源于能量优势：通过ABC转运蛋白主动摄取一个纤维三糖分子（消耗1个ATP）并在细胞内水解，可以获得三个葡萄糖分子，比摄取纤维二糖更具能效。该菌基因组中一个带有Tat（双精氨酸转运）信号肽的β-葡萄糖苷酶基因（IS481_00935）的存在，可能解释了纤维二糖在细胞外、周质和细胞质中被水解的现象。
研究证实，C. thermodepolymerans生物技术潜力的主要限制在于低效的葡萄糖利用以及纤维二糖部分细胞外水解为葡萄糖所带来的负面影响。通过引入外源的葡萄糖协助扩散蛋白Glf，成功解除了葡萄糖的转运限制。这不仅直接改善了葡萄糖的代谢，也间接解决了因纤维二糖细胞外水解产生葡萄糖而导致的底物利用效率低下问题。工程菌株Cald_GLF3在纤维二糖上表现出超乎预期的高产，原因可能是新引入的转运蛋白与原生纤维二糖转运系统产生了协同效应，或者Glf本身在高温下对纤维二糖也有一定的转运活性，这值得进一步研究。
尽管目前使用的Glf蛋白因其热敏性而迫使工程菌在次优温度下运行，但该研究已成功验证了代谢工程策略的可行性。未来的工作可以集中于通过蛋白质工程稳定Glf转运蛋白以适应更高温度，或从数据库中找到合适的热稳定同源蛋白。
综上所述，本研究系统阐明了嗜热菌Caldimonas thermodepolymeransDSM 15344对木质纤维素糖的独特利用谱，并确定其葡萄糖代谢的瓶颈在于转运而非细胞内代谢。通过引入Zymomonas mobilis的glf葡萄糖转运蛋白基因进行工程化改造，显著提升了该菌株对葡萄糖的利用能力和PHA生产效率，尤其是在纤维二糖上取得了突破性的高产。这项工作不仅深化了对嗜热菌糖代谢机制的理解，更重要的是，它通过靶向的代谢工程，有力地证明了C. thermodepolymerans作为下一代工业生物技术（NGIB）底盘，在利用可再生木质纤维素资源可持续生产生物塑料（如PHA）方面具有巨大的应用潜力和可塑性，为发展绿色生物制造提供了新的技术路径和菌种资源。
