在烟曲霉（Aspergillus fumigatus）中通过多重CRISPR/Cas9技术编辑产鹅膏毒素（gliotoxin）的基因，可降低该菌对肉鸡的致病性

《Brazilian Journal of Microbiology》：Multiplex CRISPR/Cas9 editing of gliotoxin biosynthesis genes in Aspergillus fumigatus reduces pathogenicity in broilers

通过CRISPR/Cas9多基因编辑技术敲除Aspergillus fumigatus gliZ、gliP、gliA基因，成功抑制 gliotoxin 合成与分泌。肉鸡感染实验显示，编辑后的真菌孢子未引发致病性（0%死亡率），而野生型孢子导致30%死亡率及肺部坏死等病变。该成果为靶向 gliotoxin 开发抗真菌疗法提供依据。

　　

摘要

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）产生的神经毒素（gliotoxin）因其对动物和人类的致病作用而受到了广泛研究。该毒素通过免疫抑制和细胞毒性机制引发疾病。其生物合成过程由一个包含13个基因的生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Cluster，BGC）调控。我们利用CRISPR/Cas9系统对这一基因簇中的gliZ、gliP和gliA基因进行了多基因编辑，以研究其对肉鸡的致病性。通过EuPaGDT设计crRNA，并购买了3种单导向RNA（sgRNA），每种sgRNA与Cas9结合形成核糖核蛋白复合物，用于同时转染真菌原生质体。薄层色谱分析显示硅芯片上不存在神经毒素，DNA测序结果显示目标基因中存在多种插入或缺失突变。这些突变导致三个基因产物中的氨基酸发生替换，但gliP基因的突变属于同义突变，因此可能不具有功能性影响。经过处理的原生质体成熟后形成了真菌菌丝，并诱导了孢子生成。将这些孢子接种到肉鸡的气囊中。在一周的感染试验中，接种野生型孢子的鸡（第1组）出现了病症，死亡率为30%；接种RNP处理过的孢子的鸡（第2组）仅表现出轻微的临床症状，没有死亡病例；阴性对照组（第3组）的鸡未出现任何病症或死亡。组织病理学分析显示，野生型感染鸡的肺部出现坏死和充血现象，以及炎症细胞混合聚集，而接种RNP处理过的孢子的鸡则未出现此类病变。这些结果表明，多基因编辑技术成功地在三个神经毒素基因中同时引入了插入或缺失突变，导致氨基酸替换，从而影响了神经毒素的生物合成和释放。体内实验结果表明，RNP处理过的真菌孢子无法在肉鸡体内引发烟曲霉的致病性。因此，针对神经毒素生物合成机制进行干预可能是开发抗真菌疗法的有效途径。

烟曲霉产生的神经毒素因其对动物和人类的致病作用而受到了广泛研究。该毒素通过免疫抑制和细胞毒性机制引发疾病。其生物合成过程由一个包含13个基因的生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Cluster，BGC）调控。我们利用CRISPR/Cas9系统对这一基因簇中的gliZ、gliP和gliA基因进行了多基因编辑，以研究其对肉鸡的致病性。通过EuPaGDT设计crRNA，并购买了3种单导向RNA（sgRNA），每种sgRNA与Cas9结合形成核糖核蛋白复合物，用于同时转染真菌原生质体。薄层色谱分析显示硅芯片上不存在神经毒素，DNA测序结果显示目标基因中存在多种插入或缺失突变。这些突变导致三个基因产物中的氨基酸发生替换，但gliP基因的突变属于同义突变，因此可能不具有功能性影响。经过处理的原生质体成熟后形成了真菌菌丝，并诱导了孢子生成。将这些孢子接种到肉鸡的气囊中。在一周的感染试验中，接种野生型孢子的鸡（第1组）出现了病症，死亡率为30%；接种RNP处理过的孢子的鸡（第2组）仅表现出轻微的临床症状，没有死亡病例；阴性对照组（第3组）的鸡未出现任何病症或死亡。组织病理学分析显示，野生型感染鸡的肺部出现坏死和充血现象，以及炎症细胞混合聚集，而接种RNP处理过的孢子的鸡未出现此类病变。这些结果表明，多基因编辑技术成功地在三个神经毒素基因中同时引入了插入或缺失突变，导致氨基酸替换，从而影响了神经毒素的生物合成和释放。体内实验结果表明，RNP处理过的真菌孢子无法在肉鸡体内引发烟曲霉的致病性。因此，针对神经毒素生物合成机制进行干预可能是开发抗真菌疗法的有效途径。