《Cell Regeneration》：FRZB regulates the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells in an inflammatory microenvironment through Wnt5a-mitochondrial axis
背景
牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病，主要特征是牙周组织破坏和牙槽骨吸收，是成年人牙齿丧失的主要原因。牙周膜干细胞（PDLSCs）是牙周组织中的多能干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，包括分化为成骨细胞、成纤维细胞和成牙骨质细胞等，是牙周组织工程中最常用的种子细胞。然而，炎症微环境会通过多种机制损害PDLSCs的成骨分化潜能，包括改变细胞信号通路和代谢状态。
线粒体作为细胞内ATP产生的主要场所，也是活性氧（ROS）的主要来源，在维持正常能量、氧化和代谢状态中起关键作用。线粒体功能障碍被认为是牙周炎病理机制中的一个关键环节，包括线粒体DNA损伤、氧化应激、线粒体动力学失调以及自噬和线粒体自噬缺陷。研究已证实，在牙周炎微环境中，PDLSCs表现出明显的线粒体功能障碍，包括ATP合成减少、线粒体膜电位降低和ROS水平升高，这共同导致了其再生潜能的受损。
FRZB（卷曲相关蛋白，又称sFRP3）是分泌型卷曲相关蛋白（sFRP）家族成员，作为Wnt信号通路的拮抗剂，通过直接与Wnt配体结合来调节特定细胞的生长和分化。Wnt信号通路对干细胞成骨分化的调控至关重要。Wnt5a是Wnt家族成员，主要激活非经典Wnt通路，但在特定受体环境下也能激活经典的β-连环蛋白（β-catenin）通路。值得注意的是，在炎症环境中，Wnt5a表达上调，这与PDLSCs成骨分化潜能降低相关。作为Wnt信号的分泌型拮抗剂，FRZB通过特异性结合Wnt5a并阻止其与受体相互作用，从而减弱下游信号传导，是关键的负向调节因子。然而，FRZB在炎症微环境中调控PDLSCs成骨分化的具体作用仍不明确。
本研究提出假设：炎症微环境通过下调FRZB表达、继而激活Wnt/β-连环蛋白信号通路并导致线粒体功能障碍，从而损害PDLSCs的成骨分化。
结果
PDLSCs的培养与牙周炎细胞模型建立
PDLSCs从健康牙齿的牙周膜组织中迁移出来，细胞密度随时间逐渐增加。大多数细胞呈现均一的纺锤形形态，呈涡状排列。流式细胞术分析显示，PDLSCs高表达间充质标志物CD90和CD146，而造血标志物CD45表达极低，符合间充质谱系表型。CCK-8实验表明，脂多糖（LPS）处理以剂量依赖的方式显著损害细胞活力。此外，LPS刺激24小时后，炎症细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）的表达水平显著上调，呈剂量依赖性增加，并在10 μg/mL时达到峰值，证实LPS有效诱导了炎症反应，建立了可靠的牙周炎体外模型。
LPS处理的PDLSCs表现出成骨抑制
经过21天的成骨诱导后，茜素红染色显示各实验组有不同的矿化结节模式。α-MEM组未观察到染色，而对照组则出现了大量深染的矿化结节沉积。相比之下，LPS组的结节形成明显减少，与对照组相比，结节数量更少、染色更浅。与这些观察结果一致，LPS组的光密度（OD）值显著低于对照组。这些结果表明，LPS显著损害了PDLSCs的成骨分化能力。
LPS诱导的炎症影响PDLSCs中的FRZB-Wnt5a信号轴
Western印迹分析显示，LPS处理显著下调了FRZB蛋白表达，并显著增加了β-连环蛋白水平，而Wnt5a的表达未改变。分子对接进一步预测了介导FRZB与Wnt5a界面结合的特定氨基酸残基。免疫共沉淀（Co-IP）证实了FRZB与Wnt5a之间存在直接相互作用。Western印迹和qPCR分析证实，与对照组相比，oe-FRZB组中FRZB水平有效升高，表明成功建立了FRZB过表达模型。
LPS引起线粒体异常，FRZB过表达可恢复这些异常
MitoTracker荧光染色显示，对照组和oe-FRZB组的线粒体呈现密集的网状结构，荧光信号强。相比之下，LPS组荧光强度减弱，网状线粒体结构被破坏，而oe-FRZB+LPS组的线粒体结构和荧光强度均得到恢复。透射电子显微镜（TEM）结果进一步证实，LPS诱导的线粒体形态异常，包括碎片化、长度缩短、肿胀、直径增加以及相互连接的管状线粒体网络断裂成孤立的小球状或短杆状颗粒，这些异常均可被FRZB过表达逆转。定量分析显示，与对照组相比，LPS组的相对荧光强度和线粒体分支长度显著降低，而线粒体分支直径显著增加。相反，与LPS组相比，oe-FRZB+LPS组的这些变化得到部分恢复。Western印迹分析显示，线粒体外膜蛋白Tom20在对照组和oe?FRZB组之间表达无显著差异。然而，Tom20在LPS组和oe?FRZB+LPS组中表达均显著降低，后者降低更为明显。这种降低可能是由于线粒体损伤后Tom20解离到细胞质中随后被降解所致。线粒体呼吸链蛋白COXIV在LPS组表达降低，但在oe-FRZB+LPS组得到恢复，证实FRZB过表达可减轻LPS诱导的线粒体呼吸功能损伤。
LPS导致线粒体功能障碍，FRZB过表达可逆转这些功能障碍
JC-1线粒体膜电位检测显示，对照组和oe-FRZB组呈现强烈的红色荧光和微弱的绿色荧光。相比之下，LPS组呈现强烈的绿色荧光和微弱的红色荧光。与单独的LPS组相比，oe-FRZB+LPS组的红色荧光恢复，绿色荧光减少。这种现象表明LPS处理降低了线粒体膜电位，而过表达FRZB可能部分缓解LPS引起的线粒体膜电位下降。通过观察不同实验组中线粒体膜电位、线粒体钙离子浓度和ROS水平的变化发现，在对照组中，线粒体膜电位正常，ROS水平稳定，线粒体Ca2+浓度维持在基线水平。oe-FRZB组与对照组相比，这些参数无显著差异。相比之下，LPS组表现出明显的线粒体膜电位丧失、线粒体Ca2+显著升高以及ROS水平大幅增加。值得注意的是，与LPS组相比，oe-FRZB+LPS组表现出膜电位恢复的趋势，线粒体钙积累减少，ROS产生降低，这表明FRZB过表达减轻了LPS诱导的线粒体功能障碍。
LPS抑制线粒体自噬，FRZB过表达可逆转这种抑制
Western印迹分析显示，LPS刺激下调了线粒体自噬相关蛋白（Pink1和Parkin）及自噬衔接蛋白P62的表达，同时上调了β-连环蛋白的表达。相反，在oe-FRZB组和LPS+oe-FRZB组中观察到相反的趋势。这些发现表明，炎症条件激活了Wnt/β-连环蛋白信号通路，可能抑制了自噬和线粒体自噬。过表达FRZB似乎能减弱这些效应。
LPS抑制自噬，FRZB过表达可逆转这种抑制
mCherry-GFP-LC3双荧光染色和Western印迹分析显示：在对照组中，丰富的黄色荧光表明存在一定数量的自噬体。oe-FRZB组与对照组相比，黄色斑点的分布和数量相似，表明FRZB过表达未显著影响基础自噬活性。在LPS组中，观察到黄色斑点显著减少，同时红色荧光减少，LC3II/LC3I比率下调，这表明LPS可能抑制了自噬流或破坏了自噬体成熟和降解，导致自噬体积累减少。在oe-FRZB+LPS组中，黄色斑点明显恢复，红色荧光部分增强，LC3II/LC3I比率高于LPS组。此外，与对照组和oe-FRZB组相比，LPS组中的自噬体和自溶体数量显著减少。相比之下，oe-FRZB+LPS组与LPS组相比，自噬体和自溶体数量显著增加。这些结果表明，在LPS诱导的自噬受损条件下，FRZB过表达可能恢复自噬活性并促进自噬体形成和/或成熟。
LPS降低PDLSCs的成骨能力，FRZB过表达可逆转这种影响
经过21天的成骨诱导后，对照组PDLSCs表现出明显的深红色结节。相比之下，LPS组的结节较小且染色较浅。oe-FRZB组与对照组相似，具有类似的深红色结节。值得注意的是，与LPS组相比，LPS+oe-FRZB组的结节形成增加，红色染色更深。定量分析显示，LPS组的光密度（OD562）值显著低于对照组和oe-FRZB组。相反，LPS+oe-FRZB组的OD值明显高于LPS组。这些结果表明，LPS诱导的牙周炎条件抑制了PDLSCs的成骨潜能，而FRZB过表达能有效挽救炎症挑战下的成骨分化。
讨论
由于多因素发病机制，牙周炎中的牙槽骨吸收仍然是一个主要的治疗挑战。在炎症微环境下，PDLSCs的成骨分化能力明显受损。考虑到其可及性、高增殖潜力和多能性，PDLSCs是再生应用的有希望的候选者。特别是其成骨潜能对于与牙周炎相关的骨缺损再生至关重要。
PDLSCs的表面分子标记分析（CD45?/CD90?/CD146?）证实了其间充质来源和干细胞样特性。CCK-8实验显示，炎症微环境显著抑制了PDLSCs的增殖和活力。在茜素红染色实验中，与对照组相比，LPS组的矿化结节尺寸减小、染色强度降低，表明成骨分化受损——这与牙周炎患者牙槽骨丢失和成骨缺陷的临床观察一致。相比之下，LPS+oe-FRZB组与LPS组相比，形成了更多、染色更深的矿化结节。这些结果表明，FRZB过表达挽救了炎症条件下PDLSCs的成骨潜能。
本研究通过免疫共沉淀实验证实了FRZB与Wnt5a之间的相互作用。分子对接进一步阐明了介导它们结合的特定氨基酸残基。某些卷曲受体，包括FZD4、FZD5和FZD7，已知可与Wnt5a结合并激活经典和非经典Wnt信号通路。值得注意的是，FRZB包含一个与卷曲受体结构相似的富含半胱氨酸的结构域（CRD）。通过该结构域，FRZB结合细胞外Wnt配体，并竞争性抑制其与卷曲受体的相互作用，从而抑制下游信号传导。在本研究中，LPS处理导致β-连环蛋白表达显著增加，同时FRZB表达减少。这些发现表明，炎症微环境可能下调FRZB表达，激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，从而损害PDLSCs的成骨分化潜能。
此外，LPS处理的PDLSCs表现出线粒体超微结构破坏，同时伴随线粒体膜电位升高、线粒体钙积累增加和ROS产生增强。相比之下，过表达FRZB有效减轻了这些病理变化。总之，这些发现表明炎症微环境损害了PDLSCs的线粒体功能。线粒体自噬作为一种选择性自噬，有助于清除受损的线粒体，从而保护细胞免于凋亡。在本研究中，LPS处理导致PINK1、Parkin和P62的下调，以及LC3-II/LC3-I比率的降低。这些发现表明，自噬失调可能损害PDLSCs的成骨分化潜能。提出的机制是：LPS诱导的线粒体自噬抑制，损害了细胞对受损线粒体的清除。因此，这些线粒体积累并释放ROS和促凋亡因子，促进细胞死亡或凋亡，这反映在PINK1和Parkin表达的减少上。此外，LPS似乎破坏了自噬流，证据是LC3-II降解增强以及LC3-I向LC3-II转化受损，导致LC3表达减少、自噬体减少以及整体自噬抑制。这种自噬功能障碍可能进一步加剧细胞内氧化应激，从而减弱PDLSCs的成骨能力。总之，这些结果表明，炎症微环境通过诱导线粒体功能障碍来抑制PDLSCs的成骨分化。这一观察与之前的报告一致，即牙周炎炎症环境中PDLSCs的线粒体损伤导致成骨潜能降低。
值得注意的是，本研究证实，过表达FRZB基因可在炎症条件下部分恢复线粒体功能。其机制涉及：牙周炎期间，Wnt5a与细胞膜上的卷曲受体结合，同时激活Wnt/β?连环蛋白信号通路。这种激活促进了β?连环蛋白的核积累，从而通过TCF4等转录因子抑制P62/SQSTM1基因的转录，直接降低p62 mRNA水平和从头蛋白质合成。同时，在炎症条件下，自噬过程被抑制，通过自噬-溶酶体途径降解p62受阻，理论上会导致p62积累。然而，在本研究的特定实验体系和处理时间范围内，Wnt/β?连环蛋白信号激活后由TCF4介导的p62转录抑制效应，超过了因自噬抑制导致的p62降解减少效应，最终导致总p62蛋白水平下降。当P62转录减少时，即使上游PINK1/Parkin通路被激活并标记了受损线粒体，缺乏p62作为媒介也会阻止这些标记的线粒体被有效封装到自噬体中进行降解。这直接导致受损线粒体在细胞内积累，造成线粒体功能障碍。
当Wnt蛋白与FZD受体和LRP5/6共受体结合时，GSK3β会磷酸化LRP5/6的胞质区。这导致Dvl和axin蛋白分别被募集到Frizzled和LRP5/6受体的胞质域。激活的Dvl破坏破坏复合体并抑制GSK3β介导的β-连环蛋白磷酸化，从而阻止其降解。因此，β-连环蛋白在细胞质中积累，易位到细胞核，并与TCF转录因子结合，从而抑制P62的转录和表达。P62的下调降低了PINK1的稳定性和激活，损害了Parkin的募集和激活，阻断了线粒体自噬通路，最终导致线粒体功能障碍。相比之下，FRZB可以通过同时结合Wnt蛋白和卷曲受体来抑制Wnt信号。在炎症条件下，FRZB的下调激活了Wnt/β-连环蛋白通路，从而导致线粒体功能障碍。
总之，本研究阐明了一种炎症微环境调控PDLSCs成骨的潜在机制，为牙周炎的发病机制提供了新的见解。我们的研究结果表明，FRZB通过调节Wnt信号通路来调节线粒体功能，包括ROS生成、凋亡和线粒体自噬，从而决定了炎症条件下PDLSCs的成骨能力。然而，仍需考虑一些局限性：1）虽然本研究通过体外实验提供了关键见解，但目前采用的LPS体外模型无法完全复制体内牙周炎的复杂微环境。未来仍需通过动物实验等方法进行验证，以确定这些发现的病理生理相关性；2）尽管FRZB-Wnt5a-线粒体轴是一条关键的调控通路，但炎症微环境中调控成骨分化的机制可能涉及复杂的多通路、多因素相互作用。因此，全面剖析这一复杂的调控网络将需要跨多个实验模型的综合方法。
结论
在本实验中，体外炎症微环境模型的建立揭示了PDLSCs成骨分化能力受到显著抑制。这种抑制似乎是由炎症条件下FRZB的下调所介导的，其激活了Wnt/β-连环蛋白信号通路，导致线粒体功能障碍。总之，这些结果表明，炎症微环境通过FRZB-Wnt5a-线粒体轴调节PDLSCs的成骨分化，为开发针对牙周炎的治疗策略提供了新的机制见解。
材料与方法
细胞培养
PDLSCs从健康捐赠者（年龄18–30岁）拔除的阻生第三磨牙中分离。所有程序均经南昌大学附属口腔医院伦理委员会批准（许可号：2023011），并获得了所有捐赠者的书面知情同意。排除标准包括严重龋齿、根尖周或牙周病变、吸烟史和使用某些药物。拔牙后立即将牙齿浸入含有抗生素的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。从牙根表面轻轻刮取牙周膜组织，切成1–2 mm3的小块，并均匀铺在培养皿中。让组织块在培养皿表面粘附2–4小时，然后小心添加完全生长培养基（α-MEM补充20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液）。培养物在37°C、5% CO?的加湿培养箱中维持，每2–3天更换一次培养基，直到细胞从组织块中迁移出来并达到汇合。使用第3代（P3）PDLSCs进行鉴定。对于流式细胞术，将细胞以1×105/mL的密度接种在6孔板中，在70–80%汇合度时收集，并与针对FITC-CD45、FITC-CD146、PE-CD90的荧光标记抗体在4°C孵育30分钟。PBS洗涤后，使用全光谱多色流式细胞仪分析表面标志物表达。使用FlowJo软件（版本10）进行数据分析。
炎症细胞模型建立
为建立炎症细胞模型，将PDLSCs培养至80%汇合度，并用不同浓度（0、2、5、10 μg/mL）的脂多糖（LPS）处理以诱导促炎反应。
通过Western印迹分析测定炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的蛋白水平。使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）测定细胞活力，将细胞与CCK-8试剂孵育后测量450 nm处的吸光度（光密度，OD）。实验组之间OD值的差异表明了LPS处理对细胞活性的影响。
茜素红染色
PDLSCs在成骨诱导培养基OIM（α-MEM、10% FBS、10 mM β-甘油磷酸酯、50 μg/mL抗坏血酸和100 nM地塞米松）中培养21天，每3天更换一次培养基。实验组包括：1）α-MEM组：仅使用不添加成骨诱导因子的α-MEM基础培养基培养。2）对照组：仅在OIM中培养。3）LPS组：在补充了10 μg/mL LPS的OIM中培养。4）过表达FRZB组（oe-FRZB组）：用携带FRZB过表达质粒的慢病毒载体转染PDLSCs，并在OIM中培养。5）过表达FRZB+LPS组（oe-FRZB+LPS组）：用携带FRZB过表达质粒的慢病毒载体转染PDLSCs，并在补充了10 μg/mL LPS的OIM中培养。
21天后，用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，用PBS洗涤，然后用1%茜素红溶液（pH 4.2）染色10分钟。PBS洗涤后对矿化结节进行拍照。使用10%十六烷基氯化吡啶鎓溶解钙结节。完全溶解后，将其加入96孔板，测量562 nm波长处的OD值。
线粒体功能分析
各组细胞分别用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、活性氧荧光染料（DCFH-DA）和线粒体钙离子检测试剂盒（Rhod-2 AM）在37℃、5% CO?条件下避光染色30分钟。染色后，在荧光显微镜下观察并拍照。此外，使用多功能酶标仪测量各组细胞悬浮液的荧光强度，定量分析线粒体膜电位、ROS水平和线粒体钙离子浓度的变化。
Mito-Tracker染色和mCherry-GFP-LC3荧光染色
处理24小时后，用无血清培养基洗涤细胞，并与1 μM Mito-Tracker Red CMXRos（37 °C，30分钟，避光）孵育。洗涤两次后，用1 μg/mL Hoechst 33,342（5分钟，避光）复染细胞核。再洗涤三次后，用抗淬灭封片剂封片，使用激光扫描共聚焦显微镜成像。
用5 MOI Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染细胞48小时以表达荧光标记蛋白。吸弃培养基，用无血清培养基洗涤细胞两次。使用封片剂封闭细胞样品。通过激光扫描共聚焦显微镜观察荧光斑点（指示自噬体）。
透射电子显微镜
各组细胞离心形成约绿豆大小的细胞团，然后用电子显微镜固定液重悬。使用环氧树脂812作为包埋介质对样品进行脱水和包埋。然后将包埋的标本切成厚度为60–80 nm的超薄切片。将染色的切片安装在铜网上用于电子显微镜以完成样品制备。使用透射电子显微镜观察和分析线粒体的超微结构形态。
Western印迹
用RIPA裂解缓冲液裂解PDLSCs，使用BCA蛋白测定试剂盒定量蛋白浓度。蛋白质通过10% SDS-PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时后，将膜在4°C下与针对以下靶标的一抗孵育过夜：Wnt5a、β-连环蛋白、PINK1、Parkin、LC3B和P62。第二天，用TBST洗涤膜，并与HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）/抗小鼠IgG（H+L）在室温下孵育1小时。使用增强化学发光试剂显影蛋白条带，并用化学发光检测系统成像。通过光密度定量评估蛋白表达水平。
免疫共沉淀（Co-IP）测定
取适量的PDLSCs裂解液，分别与Wnt5a和FRZB抗体在4°C孵育过夜。然后加入Protein A/G磁珠，混合物孵育2小时。随后使用磁力架分离珠子并进行洗涤。之后，加入2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5分钟解离免疫复合物。通过Western印迹分析观察FRZB与Wnt5a之间的相互作用。通过分子对接技术模拟了Wnt5a和FRZB蛋白大分子的结合位点。
统计分析
所有实验至少进行三次重复，结果以均值±标准差（SD）表示。两组比较使用双尾非配对Student's t检验。三组或以上比较采用单因素方差分析（ANOVA）。所有统计分析均使用GraphPad Prism 9版进行。统计显著性阈值设定为p< 0.05。
