《Cellular and Molecular Life Sciences》：Lnc1267-hnRNP U interaction promotes radioresistance by inhibiting apoptosis via attenuated RelA/p65 Ser536 phosphorylation
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本研究揭示了一个新发现的、在人鼠间高度保守的长链非编码RNA——lnc1267，在调控肿瘤细胞放射抗性中的关键作用。研究人员发现，电离辐射（IR）通过激活p53转录抑制lnc1267表达，进而释放其结合蛋白hnRNP U。游离的hnRNP U与IKKβ相互作用，促进RelA/p65在Ser536位点的磷酸化，最终激活NF-κB介导的促凋亡信号通路，增强细胞对放射的敏感性。这项工作首次阐明了一个由p53-lnc1267-hnRNP U/IKKβ轴构成的、调控辐射诱导细胞凋亡的新型分子机制，为克服肿瘤放疗抵抗提供了全新的潜在治疗靶点。
放疗是癌症治疗的重要手段，但其疗效常常被肿瘤细胞的“放射抗性”所限制。这种抵抗性的产生，往往与细胞凋亡（一种程序性细胞死亡）的失调密切相关。在众多调控网络中，NF-κB（核因子κB）信号通路堪称一位“双面派”，它既能帮助肿瘤细胞抵抗凋亡（促存活），有时又能促进凋亡（促死亡）。尤其是在电离辐射的刺激下，NF-κB核心亚基RelA/p65在Ser536位点的特异性磷酸化被认为是启动促凋亡功能的关键“开关”。然而，这个“开关”是如何在辐射响应中被精确调控的？其背后的分子机制至今仍是迷雾重重。与此同时，长链非编码RNA（lncRNA）作为生命科学的“暗物质”，已被证实广泛参与细胞命运调控，包括凋亡。但绝大多数lncRNA的序列在不同物种间差异巨大，这给基础研究向临床应用转化带来了巨大障碍。因此，寻找那些在进化上保守、功能关键的lncRNA，并揭示其在辐射诱导凋亡，特别是NF-κB促凋亡信号中的角色，成为一项极具挑战性又意义重大的科学命题。
为了解答这些谜题，一项发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》期刊上的研究，为我们揭开了帷幕。研究人员发现了一个前所未有、在人鼠间序列同源性高达80.43%的高度保守lncRNA，并将其命名为lnc1267。这项研究不仅首次描绘了lnc1267的生物学特性，更系统性地阐明了它如何作为一个关键的“分子刹车”，在辐射响应中通过一个精巧的“p53–lnc1267–hnRNP U/IKKβ”信号轴，抑制NF-κB的促凋亡功能，从而赋予肿瘤细胞放射抗性。这一发现不仅填补了保守lncRNA在放射生物学领域的功能空白，也为开发针对放疗抵抗性肿瘤的新型增敏策略提供了全新的理论依据和潜在靶点。
为了开展这项研究，作者团队运用了多种分子与细胞生物学关键技术。研究中使用了人结肠癌细胞HCT116和宫颈癌细胞HeLa作为主要模型，通过60Co γ射线进行照射以模拟放疗。为了操控基因表达，研究人员采用了多种手段：使用锁核酸（LNA）进行基因敲低，利用慢病毒感染构建稳定过表达细胞系，以及应用CRISPR/Cas9技术建立基因敲除细胞系。关键的机制探究实验包括：通过RNA-seq（RNA测序）和KEGG通路富集分析来筛选lnc1267调控的下游通路；使用染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）验证p53对lnc1267启动子的直接结合；通过RNA Pull-down结合质谱分析、RNA免疫共沉淀（RIP）和免疫共沉淀（Co-IP）实验，系统地验证了lnc1267与hnRNP U蛋白的相互作用，以及hnRNP U与IKKβ在辐射下的动态结合。此外，还通过Western Blot、RT-qPCR、流式细胞术（检测凋亡）和克隆形成实验（评估放射敏感性）等一系列功能实验，全面评估了lnc1267在凋亡和放射抗性中的生物学功能。
研究结果
Lnc1267是一种新的人鼠同源LncRNA
研究人员通过生物信息学比对和分子生物学验证，发现了一个位于KLF7基因内含子区、在人鼠间高度保守的序列，并将其命名为lnc1267。通过5‘和3’ RACE技术确定了其全长，并证实它不具备5‘帽子结构但具有3’ poly(A)尾巴，且编码潜能分析证实其属于非编码RNA。这些证据共同确立了lnc1267是一个新发现的、具有保守特征的lncRNA。
IR介导的p53激活抑制lnc1267转录
实验发现，随着辐射剂量增加，细胞凋亡率上升，而lnc1267的表达水平下降，二者呈负相关。机制研究表明，辐射激活了转录因子p53，而p53能直接结合到lnc1267及其宿主基因KLF7的启动子区域，从而转录抑制lnc1267的表达。这一过程不涉及lnc1267 RNA稳定性的改变，证实了辐射是通过p53依赖的转录调控来抑制lnc1267。
下调lnc1267表达增加IR诱导的细胞凋亡和放射敏感性
功能丧失实验（敲低或敲除lnc1267）显著增强了多种癌细胞系（HCT116, HeLa）以及小鼠NIH/3T3细胞的凋亡，并抑制了细胞增殖和克隆形成能力。在辐射处理后，lnc1267敲除细胞的凋亡率进一步升高，克隆形成能力则显著下降，计算得到的放射增敏比（SER）大于1，表明lnc1267的下调能增敏肿瘤细胞。反之，过表达lnc1267则能抵抗辐射诱导的凋亡。这些结果证明了lnc1267在调控细胞凋亡和放射抗性中发挥保守且关键的作用。
Lnc1267下调通过p65-Ser536磷酸化以p53非依赖的方式促进NF-κB介导的凋亡
RNA-seq和通路分析显示，lnc1267敲低后，p53和NF-κB信号通路被显著激活。Western Blot证实，敲低lnc1267能上调p53蛋白水平和RelA/p65-Ser536的磷酸化水平，并改变下游促凋亡（如PUMA）和抗凋亡（如Bcl-2）基因的表达。进一步的救援实验发现，即便在p53被敲低的情况下，lnc1267的下调仍能诱导凋亡并激活p65-Ser536磷酸化。而当使用NF-κB通路抑制剂QNZ（特异性抑制p65-Ser536磷酸化）时，lnc1267下调或辐射诱导的凋亡被有效阻断。这表明lnc1267调控的凋亡主要依赖于NF-κB通路，特别是通过p65-Ser536磷酸化，且独立于p53。
Lnc1267通过其核心功能序列FL2与HnRNP U相互作用
为了探究lnc1267的作用机制，研究人员首先分析了其亚细胞定位，发现它主要位于细胞核内。通过分段过表达实验，确定lnc1267的3‘端功能域（FL2，Δ2:4785–7531 nt）是其发挥抗凋亡作用的关键区域。接着，利用该FL2片段进行RNA Pull-down实验，结合质谱分析和生物信息学预测，鉴定出异质核核糖核蛋白U（hnRNP U）是lnc1267的相互作用蛋白。RNA Pull-down和RIP实验均证实了lnc1267与hnRNP U之间存在特异性结合。
Lnc1267通过竞争性结合HnRNP U减弱IR诱导的NF-κB激活和凋亡
已知研究显示，紫外线辐射能促进hnRNP U与IKKβ（IκB kinase β， IκB激酶β）结合，从而激活NF-κB通路。本研究发现，在电离辐射下，hnRNP U与IKKβ的结合同样增强。重要的是，过表达lnc1267可以抑制这种结合，而敲低lnc1267则会增强它。同时，敲低hnRNP U不仅能降低基础的p65-Ser536磷酸化和凋亡，还能完全逆转因lnc1267下调或辐射所导致的p65磷酸化增强和凋亡增加。这些结果表明，lnc1267扮演了一个“分子诱饵”的角色：在正常情况下，它与hnRNP U结合，阻止了后者与IKKβ的相互作用；当辐射抑制lnc1267表达后，hnRNP U被释放出来，得以与IKKβ结合，进而激活IKKβ，导致IκBα降解，RelA/p65发生Ser536磷酸化，最终启动NF-κB介导的促凋亡程序。
研究结论与讨论
本研究首次鉴定并深入阐明了一个高度保守的长链非编码RNA——lnc1267，在肿瘤放射抗性中的核心作用及其分子机制。研究者构建了一个完整的信号轴模型：电离辐射首先激活p53，p53直接结合并抑制lnc1267的转录；lnc1267表达的下降，解除了其对核蛋白hnRNP U的“禁锢”；游离的hnRNP U转而与IKKβ结合，促进了RelA/p65在Ser536位点的磷酸化，从而激活了NF-κB的促凋亡信号通路，最终增敏了肿瘤细胞对放射线的反应。
这项研究的重大意义体现在多个层面。首先，它发现了一个在人和小鼠间高度保守的lncRNA（lnc1267），这为克服lncRNA研究因物种特异性强而难以进行临床转化的普遍难题提供了突破口，意味着针对lnc1267的干预策略可能具有更好的跨物种适用性和临床转化潜力。其次，它首次揭示了p53能够直接转录调控一个lncRNA来响应辐射应激，拓展了我们对p53肿瘤抑制网络的认识。最重要的是，它阐明了NF-κB通路在辐射响应中发挥促凋亡作用的一个全新上游调控机制，即通过“lnc1267-hnRNP U”分子对来精确调控IKKβ的激活和p65-Ser536磷酸化，填补了该领域的关键知识空白。研究证实，靶向下调lnc1267能有效增强多种癌细胞的放射敏感性，这为开发新型放射增敏剂（例如基于反义寡核苷酸技术的lnc1267抑制剂）提供了坚实的理论依据和极具前景的候选靶点。尽管该研究目前主要在细胞模型中进行，其结论仍需在动物模型和临床样本中进一步验证，但它无疑为我们理解肿瘤放射抗性、设计联合放疗策略打开了新的视角，是连接非编码RNA基础研究与肿瘤放射治疗应用的一座重要桥梁。
