《Cellular and Molecular Life Sciences》：Cartilage intermediate layer protein inhibits ligamentum flavum hypertrophy mediated by TGF-β1/SMAD3/SERPINE2 signaling pathway
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腰椎管狭窄症（LSS）严重影响老年人健康，黄韧带肥厚（LFH）是其关键致病因素。本研究针对TGF-β1驱动的纤维化进程，探讨了软骨中间层蛋白（CILP）对LFH的抑制作用。研究人员综合运用生物信息学、人源组织样本、体外细胞模型及体内动物模型，证实CILP可通过负向调控TGF-β1/SMAD3/SERPINE2信号通路抑制LFH纤维化，为临床治疗提供了新的潜在靶点。
想象一下，随着年龄增长，腰椎管像年久失修的水管一样逐渐变窄，压迫着其中的神经，导致腰腿疼痛、麻木甚至行走困难。这就是腰椎管狭窄症（Lumbar Spinal Stenosis, LSS），一种严重困扰中老年人的退行性疾病。在导致腰椎管变窄的众多“元凶”中，黄韧带（Ligamentum Flavum, LF）的异常增厚，即黄韧带肥厚（Ligamentum Flavum Hypertrophy, LFH），扮演了至关重要的角色。正常的黄韧带富有弹性纤维，像一根有弹性的橡皮筋，维持着脊柱的稳定与柔韧。然而，在LFH发生时，这块韧带却发生了“质变”：弹性纤维断裂、减少，大量胶原纤维异常沉积，韧带变得又厚又硬，失去了弹性，最终挤压神经，引发一系列症状。
LFH的本质是一种纤维化病变。在这个过程中，转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1, TGF-β1）作为关键的促纤维化细胞因子被广泛关注。它就像一名“监工”，能够促进成纤维细胞转化为更具分泌能力的肌成纤维细胞，并驱动细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）过度沉积，导致韧带结构紊乱、功能丧失。因此，寻找能够有效且安全地抑制TGF-β1活性的分子，成为治疗LFH的希望所在。软骨中间层蛋白（Cartilage Intermediate Layer Protein, CILP）正是在这一背景下进入了研究者的视野。CILP是一种存在于软骨、韧带等多种结缔组织细胞外基质中的非胶原蛋白，已知其在其他组织（如心脏）中能够与TGF-β1直接结合，抑制其下游信号传导，从而对抗纤维化。然而，CILP在LFH这片“战场”上是否也能发挥同样的“制衡”作用，其具体的作用机制又如何，此前尚不清楚。
为了解开这些谜团，由国内研究团队领衔的一项深入研究在《Cellular and Molecular Life Sciences》上发表。该研究旨在系统探究CILP在LFH中的作用及其分子机制，以期为临床开发新的治疗策略提供坚实的理论基础。
为了回答上述科学问题，研究团队运用了多层次、多维度的技术方法。首先，他们通过整合分析公开的LFH基因表达谱数据集（GSE113212）和自测的黄韧带组织蛋白质组学（iTRAQ技术）数据，筛选出与LFH相关的关键差异表达基因和蛋白，并进行了生物信息学富集分析。同时，利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术解析了黄韧带组织的细胞异质性，并定位了CILP的高表达细胞类型。其次，研究纳入了临床患者队列，收集了LFH患者和非LFH（腰椎间盘突出症，LDH）患者的黄韧带组织与血清样本，通过组织病理学染色（如H&E、Masson、EVG）、免疫组化、蛋白质印迹（Western Blot）和实时定量PCR等技术，在组织水平验证了CILP及相关分子的表达。再者，研究建立了体外细胞模型，从人黄韧带组织中分离培养原代成纤维细胞，利用重组TGF-β1蛋白诱导纤维化，并通过外源性添加CILP蛋白、基因过表达（OE）或敲低（siRNA）等手段，在细胞水平探究CILP的功能及其与TGF-β1/SMAD3/SERPINE2通路的关系。最后，研究构建了在体动物模型，采用双足站立（Bipedal Standing, BS）方法诱导小鼠发生黄韧带肥厚，并利用腺相关病毒2型（AAV2）载体局部注射至小鼠黄韧带，实现CILP的定点过表达或敲低，从而在活体水平评估CILP的治疗潜力。
研究结果
转录组学分析和iTRAQ结果提示LFH中蛋白质差异表达及纤维化性质
通过对GSE113212数据集和黄韧带组织的蛋白质组学（iTRAQ）数据进行分析，研究者共鉴定出29个在转录组和蛋白质组水平均差异表达的基因/蛋白（OGPs）。生物信息学分析显示，这些OGPs显著富集于细胞外基质组织、对TGF-β的反应、ECM-受体相互作用、黏着斑等与纤维化密切相关的通路。值得注意的是，CILP在LFH组中的表达水平显著上调。蛋白质相互作用网络分析提示CILP与TGF-β1、α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）、胶原蛋白I（COL1A2）以及SERPINE2（丝氨酸蛋白酶抑制剂E2）存在潜在关联。
scRNA-seq分析LF提示LFH中蛋白质差异表达及纤维化性质
单细胞测序分析将黄韧带细胞分为12个亚群，包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、纤维软骨细胞等。CILP基因主要在纤维软骨细胞（Fibrochondrocytes）中高表达。对差异表达基因的GO和KEGG分析再次证实其与纤维化过程高度相关。
CILP和TGF-β1信号激活与LFH组织中的纤维化高度相关
临床样本分析显示，LFH患者的黄韧带明显增厚，组织学染色证实其弹性纤维排列紊乱、断裂，胶原纤维比例显著增加，纤维化评分与韧带厚度呈正相关。免疫组化、蛋白质印迹和qRT-PCR结果一致表明，在LFH组织中，CILP、TGF-β1以及纤维化标志物（胶原蛋白I和α-SMA）的表达均显著上调。
TGF-β1以时间依赖的方式刺激CILP表达并促进LF细胞纤维化
体外实验表明，用TGF-β1处理人黄韧带细胞后，可诱导细胞向肌成纤维细胞转化（Vimentin和胶原蛋白I表达增加）。同时，CILP的表达也随着TGF-β1处理时间的延长而增加，呈现时间依赖性。
CILP抑制TGF-β1诱导的SMAD3信号并抑制LFH
在TGF-β1诱导的纤维化细胞模型中，外源性添加CILP蛋白可以剂量依赖性地抑制SMAD3的磷酸化（p-SMAD3）及其核转位，并下调胶原蛋白I和α-SMA的表达。这表明CILP能够阻断TGF-β1/SMAD3信号通路的激活。
CILP可能通过调节TGF-β1/SMAD3和SERPINE2途径的反馈机制减轻LF纤维化病变
研究发现，促纤维化因子SERPINE2在LFH组织和TGF-β1刺激的细胞中表达均上调。在细胞模型中，过表达SERPINE2会增强SMAD3磷酸化和纤维化，而敲低SERPINE2则产生相反效果，且这些操作不影响CILP的表达。反之，过表达CILP能抑制SERPINE2的促纤维化作用，而敲低CILP则会加剧SERPINE2的作用。这提示CILP可能通过负向调控TGF-β1/SMAD3/SERPINE2轴来抑制纤维化。
CILP通过抑制TGF-β1/SMAD3/SERPINE2信号通路减轻体内小鼠模型的LFH
在双足站立诱导的LFH小鼠模型中，局部注射AAV2载体过表达CILP，可以显著减轻黄韧带增厚、减少胶原沉积、增加弹性纤维比例，并抑制TGF-β1、p-SMAD3、SERPINE2及纤维化标志物的表达。相反，敲低CILP则加剧了BS诱导的病理变化。这证实了CILP在活体内对LFH的抑制作用。
CILP在LFH患者和BS小鼠模型的外周血中保持稳定
值得注意的是，尽管在病变组织和细胞中CILP表达发生变化，但在LFH患者和模型小鼠的血清中，CILP水平并未显示出显著差异。这表明CILP主要发挥局部组织内的调节作用，而非系统性的生物标志物。
研究结论与讨论
本研究通过系统的多组学分析、严谨的临床样本验证、深入的细胞分子机制探索以及有效的在体动物模型实验，清晰地揭示了CILP在黄韧带肥厚中的关键作用。核心结论是：CILP在LFH中被TGF-β1诱导表达上调，作为一种内源性的负反馈调节因子，它通过抑制TGF-β1/SMAD3/SERPINE2信号轴，有效拮抗黄韧带细胞的纤维化进程，从而减轻黄韧带肥厚。
这项研究的意义重大。首先，它首次明确了CILP在LFH这一特定纤维化疾病中的保护性角色，扩展了我们对CILP生物学功能的认识。其次，研究深入阐明了CILP的作用机制，即通过干扰TGF-β1下游关键的SMAD3信号传导（抑制其磷酸化与核转位），并与另一个促纤维化因子SERPINE2形成调控环路，共同精细调控纤维化进程。这为理解LFH的复杂分子网络提供了新的视角。最重要的是，该研究为LFH的临床治疗提供了崭新的潜在策略。CILP本身作为TGF-β1的天然抑制剂，具有较高的特异性，可能避免全身性抑制TGF-β1带来的副作用。研究发现CILP在血清中稳定，暗示其局部给药（如通过AAV载体或蛋白缓释材料进行椎管内局部递送）可能是一种安全有效的治疗方式，具有广阔的转化医学前景。尽管研究存在一些局限性，例如未探索CILP在其他通路中的作用、与SERPINE2相互作用的直接分子机制有待阐明等，但本研究无疑为攻克腰椎管狭窄症这一临床难题点亮了一盏新的明灯，为未来开发靶向CILP或TGF-β1/SMAD3/SERPINE2通路的创新疗法奠定了坚实的科学基础。
