《Cellular and Molecular Life Sciences》：IQGAP1 and IQGAP3 are critical host factors for Marburg virus replication, nucleocapsid transport, and cell-to-cell spread
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本文推荐：为阐明宿主因子在马尔堡病毒(MARV)生命周期中的作用，研究人员针对IQGAP蛋白家族开展了系统性研究。通过构建多种IQGAP基因敲除(KO)细胞系，研究发现IQGAP1和IQGAP3是支持MARV转录/复制、核衣壳(NC)长距离运输及病毒传播的关键宿主因子，而IQGAP3在病毒释放环节作用尤为突出。该发现为理解丝状病毒与宿主细胞骨架的相互作用及开发新型抗病毒策略提供了重要线索。
在病毒与宿主的永恒博弈中，病原体常常“劫持”宿主细胞的正常机能为己所用。马尔堡病毒(Marburg virus, MARV)作为一种高致死性的丝状病毒，其反复爆发的疫情持续威胁着公共卫生安全。病毒的生存和扩散高度依赖于宿主细胞的内环境，其中，细胞骨架系统——特别是由肌动蛋白(actin)构成的动态网络——是许多病毒操纵以完成自身生命周期(如进入、细胞内运输和释放)的关键靶标。那么，MARV是如何巧妙地利用宿主细胞骨架来实现高效复制和传播的呢？这其中又有哪些关键的宿主蛋白在“助纣为虐”？发表于《Cellular and Molecular Life Sciences》的这项研究，为我们揭开了谜底的一角，将目光聚焦于一个名为IQGAP的宿主蛋白家族。
先前的研究曾发现，支架蛋白IQGAP1会被招募至MARV感染后形成的包涵体(inclusion bodies, IBs)中，并与运动的核衣壳(nucleocapsids, NCs)相关联。然而，IQGAP蛋白家族共有三个成员(IQGAP1, IQGAP2, IQGAP3)，它们在MARV感染的全过程中各自扮演何种角色？是否都是病毒复制所必需的？为了回答这些问题，研究团队开展了一项系统而深入的研究。
研究人员主要运用了几项关键技术：首先，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在人肝癌细胞(Huh-7)中构建了IQGAP1、IQGAP3的单敲除(KO)、双敲除(IQGAP1+3KO)以及三成员全部敲除(IQGAPallKO)的稳定细胞系。其次，通过活细胞成像技术与IMARIS软件分析，对表达荧光标记蛋白VP30的MARV感染细胞进行长时间序列拍摄，追踪并量化病毒核衣壳的运输轨迹和位移效率。此外，研究还采用了病毒微型基因组(Minigenome)测定法来特异性评估病毒转录/复制活性，并利用TCID50测定和病灶形成(Focus-forming)实验来分别定量病毒释放效率和细胞间传播能力。免疫荧光染色与共聚焦显微镜则用于观察蛋白的亚细胞定位及其与病毒结构的共定位情况。
研究结果
1. IQGAPs在MARV感染细胞中的亚细胞定位
研究人员首先在MARV感染的细胞中表达了绿色荧光蛋白(GFP)标记的三种IQGAP蛋白。结果显示，所有三种IQGAP蛋白均定位于病毒形成的包涵体(IBs)中，并且约70%的IBs呈现IQGAP阳性。更重要的是，所有三种GFP-IQGAP蛋白均能在细胞质中运动的核衣壳一端形成“尾迹”状凝聚物，表明它们与运动的病毒核衣壳直接相关。活细胞成像进一步证实了这一点。
2. IQGAP敲除对细胞骨架的影响
为了探究IQGAP的功能，研究团队构建并验证了多种IQGAP敲除细胞系。这些敲除细胞普遍表现出肌动蛋白细胞骨架的重排，特征是出现明显的应力纤维，而丝状伪足(filopodia)的数量似乎减少。通过FiloQuant插件定量分析发现，三敲除细胞(IQGAPallKO)的丝状伪足密度显著降低。将单个GFP-IQGAP蛋白回补到三敲除细胞中，可以部分恢复细胞骨架的动态性，证实了敲除表型的特异性以及所用GFP-IQGAP构建体的功能性。
3. IQGAP蛋白调控细胞对MARV感染的易感性
感染实验表明，所有IQGAP敲除细胞系仍可被MARV感染，但其感染效率受到影响。与对照细胞相比，IQGAP3单敲除、IQGAP1+3双敲除以及三敲除细胞中，感染细胞的数量分别出现显著下降，其中双敲除和三敲除细胞降低了约60%。定量PCR检测细胞内病毒RNA拷贝数也显示，IQGAP3敲除导致病毒RNA合成显著减少，且在双敲除和三敲除细胞中减少更为明显。
4. IQGAP1和IQGAP3对MARV转录/复制活性的影响
为了直接评估IQGAPs对病毒RNA合成的影响，研究人员采用了MARV特异性微型基因组测定法。结果表明，IQGAP3的缺失（无论是单独缺失还是与IQGAP1或IQGAP2共同缺失）会导致报告基因活性显著降低约60%，而IQGAP1单敲除的影响不显著。然而，在三敲除细胞中回补IQGAP1能显著恢复报告基因活性。这说明IQGAP3对MARV的转录/复制效率具有重要支持作用。
5. IQGAPs并非核衣壳处肌动蛋白尾形成所必需，但影响其长距离运输
活细胞成像显示，即使在完全缺失IQGAPs的三敲除细胞中，病毒核衣壳一端仍能形成肌动蛋白尾，并产生运动，表明IQGAPs对于肌动蛋白尾的初始形成并非绝对必需。然而，对核衣壳运动轨迹的量化分析发现，在对照细胞中，有1.62%的轨迹位移超过5微米（这可能足以将核衣壳从核周的IBs运输到质膜）。这一比例在IQGAP3单敲除、双敲除和三敲除细胞中均显著下降，但在IQGAP1单敲除细胞中变化不显著。这表明IQGAPs（特别是IQGAP3）虽然不负责启动肌动蛋白聚合，但能调节核衣壳长距离、高效位移的效率。
6. IQGAP1和IQGAP3共同支持MARV的释放
通过滴定感染细胞上清液中的病毒滴度(TCID50)，研究人员评估了病毒释放效率。结果显示，IQGAP1单敲除导致病毒释放减少约30%（不显著），而IQGAP3单敲除则导致显著降低65%。当IQGAP1和IQGAP3同时缺失时（双敲除或三敲除），病毒释放的减少更为严重，达到70-80%。这提示IQGAP1和IQGAP3在支持病毒释放方面具有协同或互补作用。
7. IQGAP1和IQGAP3支持MARV的细胞间传播
病灶形成实验用于评估病毒在细胞培养中的直接扩散能力。结果显示，IQGAP1敲除导致病灶大小减少61%，影响显著；IQGAP3敲除导致减少27%；而双敲除和三敲除导致的减少程度与IQGAP1单敲除相似（约70%）。这表明在细胞间传播过程中，IQGAP1的作用比IQGAP3更为关键。
结论与意义
本研究系统阐明了IQGAP蛋白家族，特别是IQGAP1和IQGAP3，在MARV感染周期中的多重关键作用。它们被招募至病毒复制工厂（包涵体）和运动核衣壳上，通过调节肌动蛋白动力学，在多个环节支持病毒的生命活动：IQGAP3主要影响病毒的转录/复制效率和释放；而IQGAP1则在核衣壳的长距离运输和细胞间传播中扮演更重要的角色。两者的功能既有侧重，又在支持病毒释放等方面存在协同。
这项研究的意义在于：首先，它首次全面解析了IQGAP家族不同成员在丝状病毒感染中的分工，将IQGAP3推至抗病毒研究的前沿。其次，研究揭示了病毒如何精细调控宿主细胞骨架来实现高效复制和传播的新机制，即不依赖IQGAPs启动肌动蛋白尾，而是利用其来“优化”运输效率和病毒产出。最后，IQGAP1和IQGAP3作为关键的“促病毒”宿主因子，为开发针对宿主而非病毒本身的广谱抗丝状病毒策略提供了极具潜力的新靶点。通过干预这些宿主因子，有可能在不引发病毒耐药性的前提下，有效抑制病毒的复制和传播，为应对未来的疫情爆发储备新的武器。
