《Inflammation》：Oxidized Phospholipids Aggravate Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury by Promoting Macrophage M1 Polarization Via Regulating the Wnt/β-catenin/Autophagy Axis
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为解决肝脏缺血/再灌注损伤(IRI)这一临床重大难题，研究人员深入探讨了损伤相关分子模式(DAMPs)成员——氧化磷脂(OxPLs)在其中扮演的角色。研究发现，OxPLs在肝脏IR后会过度积累，并通过激活Wnt/β-catenin通路、抑制巨噬细胞自噬，从而驱动其向促炎的M1表型极化，最终加重肝脏损伤。该研究揭示了OxPLs在肝脏IRI中的新机制，为中和OxPLs（例如使用抗体E06）以减轻术后肝损伤提供了新的潜在治疗策略。
肝脏移植和部分肝切除手术是治疗终末期肝病和肝脏肿瘤的重要手段，但这些手术过程中一个几乎无法避免的“副作用”便是肝脏缺血/再灌注损伤。想象一下，当肝脏的血液供应被暂时阻断（缺血），随后又恢复（再灌注），这个过程本身就会对肝组织造成二次打击，引发严重的炎症和细胞死亡，直接影响手术效果和患者康复。随着全球人口老龄化和代谢相关脂肪性肝病（MASLD）患病率的上升，肝脏变得更为脆弱，对缺血/再灌注损伤也更加敏感。因此，深入探究其发生机制，寻找有效的干预靶点，一直是肝脏外科领域的研究热点。
在这一复杂的损伤过程中，先天免疫系统的“哨兵”——巨噬细胞扮演着核心角色。它们能够感知组织损伤释放的“危险信号”，并迅速被激活。活化的巨噬细胞具有功能可塑性，主要可分为两类：一类是促炎的M1型巨噬细胞，它们会分泌大量如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-1β (IL-1β)等炎症因子，“火上浇油”般加剧组织损伤；另一类是抗炎的M2型巨噬细胞，它们则致力于促进组织修复、平息炎症。在肝脏缺血/再灌注损伤的早期，往往是M1型巨噬细胞占主导，它们的过度活化是驱动炎症恶性循环、加重肝细胞凋亡和微循环障碍的关键环节。那么，是什么“危险信号”在背后驱动巨噬细胞向有害的M1表型极化呢？
本研究将目光投向了氧化磷脂。磷脂是细胞膜的基本组成成分，遍布全身。在缺血/再灌注等氧化应激条件下，磷脂极易被氧化，形成一类具有生物活性的氧化磷脂。近年来，氧化磷脂被认为是损伤相关分子模式家族的重要成员，即在组织损伤时内源性产生、并能触发先天免疫激活的关键分子。在心肌缺血/再灌注损伤等模型中，氧化磷脂已被证实具有促炎和加重损伤的作用。然而，在肝脏缺血/再灌注损伤这一特定场景中，氧化磷脂究竟扮演什么角色？它是如何影响巨噬细胞命运的？其中的分子机制又是怎样的？这些问题尚未明确。为了回答这些问题，研究人员在《Inflammation》杂志上发表了他们的最新研究成果。
为开展此项研究，研究人员综合运用了多种技术方法。研究队列包括44名接受肝部分切除术合并肝门阻断的良性肝病患者，采集了其术前术后血清和肝活检组织。同时，建立了小鼠肝脏热缺血/再灌注损伤模型，并通过门静脉注射氧化磷脂中和抗体E06或外源性氧化磷脂进行干预。在细胞层面，采用了肝细胞缺氧/复氧模型、从骨髓中提取培养原代巨噬细胞以及使用RAW264.7巨噬细胞系进行体外实验。关键检测技术包括：使用E06抗体通过免疫组化和竞争性酶联免疫吸附试验检测组织和血清中氧化磷脂水平；通过苏木精-伊红染色、TUNEL染色、血清转氨酶测定和流式细胞术评估肝损伤和细胞凋亡；利用免疫荧光、流式细胞术、蛋白质印迹法和定量聚合酶链式反应分析巨噬细胞表型（M1/M2）标记物、炎症因子及自噬相关蛋白的表达；通过细胞组分分离、蛋白质印迹和免疫荧光观察β-连环蛋白的核转位；此外，还对公共数据库中的测序数据进行了基因本体和京都基因与基因组百科全书通路富集分析。
研究人员首先证实了氧化磷脂在肝脏缺血/再灌注损伤中的积累。对临床样本的分析显示，患者肝组织和血清中的氧化磷脂水平在肝门阻断后显著升高，且血清氧化磷脂升高幅度与缺血时间呈正相关。在小鼠模型中，血清氧化磷脂水平在再灌注6小时达到峰值，与炎症损伤的高峰期吻合。在体外的肝细胞缺氧/复氧模型上清液中，也观察到了氧化磷脂的升高。这些结果清晰地表明，氧化磷脂在肝脏缺血/再灌注损伤过程中大量产生并积累。
接下来，研究探讨了氧化磷脂积累与肝损伤的直接关系。临床数据中，血清氧化磷脂水平与肝损伤指标（sALT, sAST）呈正相关。在动物实验中，预先通过门静脉给予中和抗体E06，能显著减轻肝脏的组织学损伤、减少凋亡细胞数量、降低血清转氨酶水平。相反，额外补充外源性氧化磷脂则会加剧肝损伤。这些证据表明，氧化磷脂的积累是加重肝脏缺血/再灌注损伤的重要因素。
那么，氧化磷脂是如何加剧损伤的呢？作为损伤相关分子模式，其很可能通过招募和激活免疫细胞来驱动炎症反应。研究证实，氧化磷脂能促进中性粒细胞和单核细胞向损伤肝脏的浸润，上调肝脏中CXCL1、CXCL2、CXCL5等趋化因子的表达，并显著提升血清中TNF-α、IL-1β、MCP1等促炎细胞因子的水平。而使用E06抗体中和氧化磷脂，则可以逆转这些效应。
研究的重点随后放在了巨噬细胞上。巨噬细胞是肝脏缺血/再灌注损伤炎症反应的主要协调者。通过组织免疫荧光、免疫组化、流式细胞术等多种方法，研究人员发现氧化磷脂能显著促进肝脏巨噬细胞向M1表型极化。在缺血再灌注小鼠肝脏中，给予氧化磷脂会升高M1标志物iNOS和CD86的表达，增加F4/80+CD86+巨噬细胞的比例；而使用E06抗体则能抑制这种M1极化。更重要的是，当用氯膦酸盐脂质体清除肝脏巨噬细胞后，不仅基础肝损伤减轻，氧化磷脂的加重损伤效应也消失了，且E06与氯膦酸盐联用未显示叠加效果。这证明巨噬细胞是氧化磷脂发挥促炎作用不可或缺的“执行者”。
为了深入机制，研究转入体外实验。用脂多糖和干扰素-γ诱导RAW264.7巨噬细胞向M1极化时，加入氧化磷脂能进一步上调CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β等M1相关标志物的表达和分泌，证实氧化磷脂直接促进巨噬细胞M1极化。
那么，氧化磷脂是通过什么途径来调控巨噬细胞极化的呢？通过对公共数据库的转录组分析，研究人员发现自噬相关通路和Wnt/β-catenin通路在氧化磷脂调控的基因中富集显著。体外实验表明，氧化磷脂处理能抑制巨噬细胞的自噬流，表现为微管相关蛋白1轻链3-II (LC3-II)和自噬关键蛋白Beclin1表达降低，而自噬底物p62 (SQSTM1)堆积增加。
同时，氧化磷脂处理能诱导β-catenin从细胞质向细胞核内转位，标志着Wnt/β-catenin通路被激活。当使用该通路的特异性抑制剂ICG-001时，氧化磷脂引起的自噬抑制被逆转。进一步研究发现，用自噬诱导剂雷帕霉素激活自噬，可以抑制氧化磷脂诱导的M1极化（表现为iNOS和CD80表达下降）；反之，用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤抑制自噬，则会诱导M1极化，并能抵消ICG-001对氧化磷脂促M1极化效应的抑制作用。这一系列精巧的实验形成了一个完整的逻辑链条：氧化磷脂通过激活Wnt/β-catenin通路，抑制了巨噬细胞的自噬，而自噬的抑制进而驱动了巨噬细胞向促炎的M1表型极化。
综合以上所有结果，本研究得出结论：在肝脏缺血/再灌注损伤过程中，会过量产生氧化磷脂。这些氧化磷脂作为损伤相关分子模式，通过激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制巨噬细胞的自噬，从而推动巨噬细胞向促炎的M1表型极化。M1型巨噬细胞的过度活化进一步放大了炎症反应，最终导致更严重的肝脏损伤。因此，靶向中和氧化磷脂（例如使用天然抗体E06）的策略，有望通过打断这一恶性循环，为减轻肝脏手术后的缺血/再灌注损伤提供一种新的治疗思路。
在讨论部分，作者强调了本研究的发现不仅深化了对肝脏缺血/再灌注损伤机制的理解，也可能对其他以慢性炎症为特征的肝脏疾病（如代谢相关脂肪性肝病）具有启示意义，因为损伤相关分子模式在其中普遍存在。当然，研究也存在一些局限性，例如临床样本量有限，研究主要聚焦于巨噬细胞，而氧化磷脂可能对其他免疫细胞也有影响。未来需要在更大规模的患者队列中进行验证，并探索将这一 preclinical 发现转化为临床应用的潜力。总之，这项研究揭示了氧化磷脂在肝脏缺血/再灌注损伤中的关键作用和一条清晰的分子机制轴，为开发新的肝保护策略奠定了重要的理论基础。
