mTOR通路通过抑制自噬流介导脓毒症中CD4+T细胞的内质网应激-凋亡

《Inflammation Research》：mTOR pathway mediates the endoplasmic reticulum stress -apoptosis of CD4+?T cell through inhibiting autophagy flux in sepsis

本研究为解决脓毒症免疫抑制状态下CD4+T细胞大量耗竭的难题，聚焦于mTOR通路、内质网应激（ERS）与自噬间的调控网络。研究人员利用基因敲除与药理学干预模型，深入探讨了mTOR对ERS诱导的CD4+T细胞凋亡的调控机制。结果发现，脓毒症中mTOR活性异常激活，导致自噬流受阻，进而加重了CD4+T细胞的ERS-凋亡；而敲除mTOR或使用抑制剂雷帕霉素能恢复自噬流，缓解细胞凋亡。该研究首次阐明mTOR-自噬-ERS-凋亡轴，为靶向mTOR改善脓毒症免疫抑制提供了新策略。

　　

脓毒症是一种由宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，是全球公共卫生面临的严峻挑战。尽管在源头控制、抗生素和多器官支持治疗方面有所进展，但其死亡率依然居高不下。这种困境背后，免疫系统的“瘫痪”是关键推手之一。在脓毒症后期，免疫细胞大量死亡、功能耗竭，其中，适应性免疫的“指挥官”——CD4⁺T细胞尤为脆弱。它们的缺失直接削弱了抗原特异性免疫，与后续的继发感染和死亡风险密切相关。那么，是什么导致了这些关键免疫细胞的大量死亡？研究者们将目光投向了细胞内一个重要的“质量控制中心”——内质网。在脓毒症引发的氧化应激、细胞因子风暴等复合打击下，内质网不堪重负，错误折叠的蛋白质堆积，触发了一种称为“内质网应激”的警报。适度的应激本是细胞的自救尝试，但当压力超过极限，信号就会转向促凋亡程序，启动细胞“自杀”开关。与此同时，细胞还有另一套“垃圾清理”系统——自噬。自噬能够清除受损的细胞器和错误折叠的蛋白，理论上可以缓解内质网的压力，阻止其走向凋亡。然而，在脓毒症这场风暴中，自噬系统自身是否还能正常运转？一个名为“雷帕霉素机制靶点”的关键调控分子进入了研究视野。mTOR是细胞感知营养和能量状态的核心枢纽，对细胞生长、代谢和自噬等过程有着全方位的调控作用。它就像一个总开关，当mTOR活跃时，通常会抑制自噬的发生。那么，在脓毒症中，异常的mTOR信号是否通过“关闭”自噬，从而将内质网应激推向不可逆的凋亡深渊，最终导致CD4⁺T细胞的耗竭？为了回答这个关键问题，研究人员开展了一项深入机制探索的研究，其成果最终发表在《Inflammation Research》期刊上。

为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术方法：首先，建立了经典的盲肠结扎穿孔（CLP）小鼠脓毒症模型，并使用了T细胞特异性mTOR基因敲除和TSC1（mTOR上游抑制因子）基因敲除小鼠，以在体内研究特定基因功能。其次，通过流式细胞术结合膜联蛋白V（Annexin V）和碘化丙啶（PI）染色，定量检测CD4⁺T细胞的凋亡率。再者，利用蛋白质印迹法检测了与凋亡、内质网应激、自噬及mTOR通路相关的一系列蛋白标志物的表达水平。此外，还运用透射电子显微镜直接观察了CD4⁺T细胞的内质网和自噬体等超微结构变化。在干预手段上，研究使用了内质网应激抑制剂4-苯基丁酸、自噬流抑制剂巴弗洛霉素A1以及mTOR抑制剂雷帕霉素进行药理学验证。

研究结果

脓毒症中CD4⁺T细胞凋亡显著增加且由内质网应激介导

与假手术组相比，CLP脓毒症模型小鼠脾脏CD4⁺T细胞的凋亡比例显著升高。同时，促凋亡蛋白Bax和切割后的caspase-3表达上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调。内质网应激的标志蛋白GRP78和CHOP在脓毒症组也明显上调，并且透射电镜观察到了内质网扩张和囊泡化等典型应激形态。使用内质网应激抑制剂4-PBA进行预处理后，不仅内质网应激标志物下降，CD4⁺T细胞的凋亡也得到显著缓解。这证实了内质网应激是驱动脓毒症中CD4⁺T细胞凋亡的关键机制。

mTOR在内质网应激诱导的CD4⁺T细胞凋亡中的作用

研究发现，脓毒症小鼠CD4⁺T细胞中mTOR通路被显著激活。通过使用T细胞特异性mTOR敲除小鼠，研究人员发现，敲除mTOR能够降低脓毒症小鼠CD4⁺T细胞中GRP78和CHOP的表达，同时减少细胞凋亡，表现为凋亡率下降、Bax和caspase-3表达降低、Bcl-2表达升高。相反，敲除mTOR的上游抑制因子TSC1（相当于促进mTOR活性）则会加剧细胞凋亡，而这种促凋亡效应可被4-PBA阻断。这表明抑制mTOR通路可以减轻脓毒症中的内质网应激及其诱导的CD4⁺T细胞凋亡。

脓毒症中自噬功能显著受损

自噬是一个动态过程，自噬流（从自噬体形成到与溶酶体融合降解）的通畅至关重要。研究发现，脓毒症组CD4⁺T细胞中，自噬体标志蛋白LC3-II与LC3-I的比值升高，但同时自噬底物p62蛋白也累积性增加，这提示自噬体形成可能增加，但后续的降解步骤受阻，即自噬流受损。透射电镜结果也支持了这一结论，在脓毒症组细胞中观察到大量未降解的双层膜自噬体积累，而成熟的单层膜自噬溶酶体较少。

mTOR缺失通过恢复自噬流来缓解ERS-凋亡

与脓毒症对照组相比，mTOR敲除小鼠的CD4⁺T细胞表现出更高的LC3-II/LC3-I比值，但p62蛋白水平却显著降低，这标志着自噬流的恢复。电镜照片也显示mTOR敲除组细胞内有更多的自噬溶酶体。为了验证恢复的自噬流是否介导了mTOR缺失的抗凋亡作用，研究使用了自噬体-溶酶体融合的特异性抑制剂巴弗洛霉素A1。结果显示，在mTOR敲除的脓毒症小鼠中使用巴弗洛霉素A1，会逆转mTOR缺失带来的保护效应，重新升高内质网应激标志物和细胞凋亡率。这证明mTOR缺失正是通过修复受损的自噬流，来缓解内质网应激诱导的细胞凋亡。

靶向mTOR可改善预后并显示出巨大的临床治疗潜力

为了探索临床转化价值，研究人员使用了mTOR的经典抑制剂雷帕霉素进行药理学干预。结果发现，雷帕霉素处理能够模拟基因敲除的效果，显著降低脓毒症小鼠CD4⁺T细胞的凋亡率。同时，靶向mTOR的干预还能部分纠正脓毒症导致的细胞因子（如INF-γ和IL-10）分泌紊乱。生存分析进一步表明，无论是基因敲除还是雷帕霉素治疗，都能不同程度地延长脓毒症小鼠的生存时间。这为将mTOR抑制剂应用于脓毒症免疫调理治疗提供了临床前证据。

结论与讨论

本研究的核心结论是，在脓毒症中，mTOR通路过度激活，通过抑制自噬流（特别是自噬体-溶酶体融合步骤），加剧了CD4⁺T细胞的内质网应激，并将其导向凋亡。而通过遗传学（敲除mTOR）或药理学（使用雷帕霉素）手段抑制mTOR，可以恢复自噬流的功能，从而减轻内质网应激，保护CD4⁺T细胞免于凋亡。这首次清晰地阐明了“mTOR-自噬-内质网应激-凋亡”这一调控轴在脓毒症CD4⁺T细胞耗竭中的作用。

该研究具有多重重要意义。首先，在理论层面，它将免疫代谢的核心调控因子mTOR、细胞器的质量控制（内质网应激与自噬）和免疫细胞的命运（凋亡）在脓毒症这一复杂疾病模型中紧密联系起来，深化了对于免疫抑制机制的理解。以往的研究多关注单一通路，而本研究揭示了这些关键生物学过程之间的因果联系和层级关系。其次，在转化医学层面，研究结果为开发新的脓毒症辅助治疗策略提供了明确靶点。mTOR抑制剂（如雷帕霉素及其衍生物）是临床上已使用的药物（如用于器官移植抗排异），本研究为其“老药新用”，重定位为脓毒症免疫调节剂提供了坚实的科学依据。通过靶向mTOR，可能有助于扭转脓毒症后期的免疫麻痹状态，促进宿主免疫功能的恢复，从而降低继发感染风险和死亡率。最后，该研究聚焦于CD4⁺T细胞这一免疫系统的关键枢纽细胞，其生存状态的改善有望对整个适应性免疫应答的重建产生积极影响。

当然，研究也存在一些局限，例如对自噬流的评估主要基于静态的蛋白标志物，未来可借助动态报告系统进一步验证；研究主要聚焦于脾脏这一淋巴器官，脓毒症是全身性疾病，其他重要器官中免疫细胞的状态是否遵循相同规律有待探索。尽管如此，这项研究无疑为我们理解脓毒症免疫失调打开了一扇新的窗口，并为未来开发靶向mTOR-自噬轴的治疗方案奠定了重要的基础。