《Inflammation Research》：Spatial transcriptomics identifies IL-32 as a lipid droplet-associated cytokine linked to tubular injury in human diabetic kidney disease
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为了解决糖尿病肾病(DKD)中脂质积累与炎症信号之间的分子联系尚不明确这一核心问题，研究人员通过Nile Red光谱、数字空间转录组学和单细胞空间转录组学等技术，对来自不同病理分级DKD患者肾活检样本进行研究。结果表明，白细胞介素32 (IL-32)作为一种脂滴(LD)相关细胞因子，在损伤的近端肾小管中被显著上调，并与中性粒细胞和巨噬细胞浸润密切相关。这项研究发表在《Inflammation Research》，其意义在于为理解人类DKD中脂毒性、肾小管损伤与炎症之间的分子桥梁提供了关键证据，提示IL-32可能是潜在的诊断标志物和治疗靶点。
糖尿病肾病 (Diabetic kidney disease, DKD) 已成为全球慢性肾脏病 (chronic kidney disease, CKD) 和肾衰竭的首要原因。尽管其发病机制复杂，但近年来，肾脏细胞内的脂质异常堆积和随之而来的炎症反应，被认为是推动疾病进展的两大“幕后推手”。在糖尿病环境中，过量的游离脂肪酸涌入肾脏细胞，它们起初被“打包”成脂滴 (lipid droplets, LD) 储存起来，这本是一种自我保护机制。然而，持续的“超额存储”最终会导致“仓库”爆满，引发所谓的“脂毒性”，损害细胞功能。然而，一个关键的科学谜题一直悬而未决：脂质的异常代谢是如何“点燃”肾脏内的炎症“火焰”，从而加速肾损伤和纤维化的？这道连接脂质与炎症的分子桥梁究竟是何模样？为了解答这个问题，一支研究团队在《Inflammation Research》杂志上发表了一项突破性研究，他们利用前沿的空间生物学技术，在人类DKD患者的肾脏样本中进行了一次“细胞级”的精准探查。
研究团队运用了几个关键技术方法来解析这一复杂问题。首先，他们收集了来自对照个体和不同病理分级 (I-IV类) DKD患者的肾活检样本，构建了研究队列。核心的技术手段包括：1) 使用尼罗红 (Nile Red) 荧光染色结合光谱分析，对组织切片中的脂滴进行定量和表征；2) 采用NanoString GeoMx 数字空间转录组分析技术，在保留组织空间位置信息的前提下，对特定区域 (如肾小球、损伤与未损伤的近端肾小管) 进行靶向转录组分析；3) 利用NanoString CosMx 单细胞空间分子成像技术，在单细胞分辨率下同时对上千个基因进行空间转录组分析，从而精确鉴定细胞类型和基因表达谱。此外，RNAscope原位杂交和免疫荧光显微技术被用于验证关键靶点 (如IL-32) 的mRNA和蛋白表达及定位。
研究结果
Increased lipid droplets in diabetic kidney disease (糖尿病肾病中脂滴增加)
研究人员首先通过尼罗红染色发现，脂滴的丰度随着DKD病理分级的升高而增加，尤其在近端肾小管中最为显著。在肾小球中，脂滴数量在III类DKD达到顶峰后，在IV类（晚期肾小球硬化）中下降；而在肾小管中，脂滴积累在III类达到峰值并在IV类持续保持高水平。此外，DKD患者肾小管中的脂滴体积倾向于更大。这表明脂滴的积累与DKD病理严重程度相关，且主要变化发生在肾小管区室。
Identification of IL-32, a lipid droplet-associated protein in DKD (鉴定IL-32为DKD中一种脂滴相关蛋白)
为了寻找与脂滴积累和肾小管损伤相关的关键分子，研究者对对照和DKD样本进行了GeoMx空间转录组分析。在DKD样本中上调最显著的基因中，他们关注到了编码白细胞介素32的IL32基因。进一步分析显示，IL32在DKD的肾小球以及损伤的 (KIM1阳性) 近端肾小管中表达显著上调。RNAscope实验证实了IL32 mRNA在DKD近端肾小管中的高表达。随后的免疫荧光实验发现，IL-32蛋白在DKD II至IV类患者的肾活检中大量表达，尤其是在LTL (lotus tetragonolobus lectin) 信号较弱（提示损伤）的近端肾小管中，并以点状模式存在。重要的是，IL-32的点状信号与脂滴标志物perilipin 2 (PLIN2) 高度共定位，并且在DKD组织中共定位程度显著高于对照，证实IL-32是一种与脂滴相关的细胞因子，在DKD损伤的近端肾小管中上调。
Spatial transcriptomics identifies IL32 as a DKD gene-of-interest (空间转录组学鉴定IL32为DKD关注基因)
为进一步验证，研究者使用CosMx单细胞空间转录组技术分析了涵盖对照至DKD IV类的17例患者样本。细胞分群鉴定出包括近端肾小管、损伤近端肾小管 (iPT，以HAVCR1/KIM1表达为标志)、足细胞、内皮细胞及多种免疫细胞在内的16个细胞簇。差异表达分析再次将IL32列为DKD中最显著上调的基因之一。基因表达热图和点图显示，IL32表达的上调主要特异性地发生在近端肾小管细胞（包括健康和损伤的），而在内皮细胞和足细胞中变化不大。
Tubular injury correlates with IL32 expression in DKD (肾小管损伤与DKD中IL32表达相关)
深入分析CosMx数据发现，IL32表达在损伤的近端肾小管 (iPT) 群体中显著高于健康的近端肾小管，且这种差异在所有DKD分级中均存在。空间转录图谱可视化显示，IL32的高表达区域与注释为损伤近端肾小管的细胞位置高度重合。此外，IL32在表达另一个损伤标志物VCAM1的细胞中也更高。相比之下，其他炎症细胞因子 (如TNF, IL6) 在近端肾小管中的表达变化远不如IL32明显。重要的是，IL32在巨噬细胞、T细胞、B细胞或中性粒细胞等免疫细胞中并未检测到高于健康近端肾小管阈值水平的表达，强调了其在肾小管上皮细胞损伤中的特异性。
IL32-expressing proximal tubules exist in pro-inflammatory cellular communities (表达IL32的近端肾小管存在于促炎性细胞群落中)
空间邻近性分析显示，与对照相比，DKD样本中总免疫细胞（T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞）比例增加。特别值得注意的是，巨噬细胞显著更靠近损伤的近端肾小管细胞，而B细胞和中性粒细胞则呈远离趋势。免疫荧光实验验证了这一发现，CD68阳性的巨噬细胞更密集地聚集在IL-32阳性的近端肾小管周围，而非未损伤的LTL阳性/IL-32阴性肾小管周围。这提示表达IL-32的损伤肾小管可能创造或存在于一个促炎的微环境中。
为了探究IL-32在疾病不同阶段的作用，研究者根据组织学特征（免疫浸润、胶原沉积、HAVCR1表达等）将DKD组织区域划分为“活动性”和“慢性”表型。分析发现，在定义为“活动性”的区域（高HAVCR1表达，免疫浸润较多但胶原沉积较少），IL32表达更高；而在“慢性”区域（低HAVCR1，高胶原沉积，纤维细胞/肌成纤维细胞增多），胶原基因 (COL4A1, COL4A2) 表达更高。活动性区域含有更多巨噬细胞和中性粒细胞，而慢性区域则有更多T和B淋巴细胞。这表明IL-32的表达与活动性的肾小管损伤和炎症阶段更为相关。
结论与讨论
本研究通过多种互补技术，首次在人类DKD中鉴定出IL-32是一种在损伤的近端肾小管内与脂滴相关的细胞内细胞因子。其表达水平随着细胞脂滴的增加而升高，并且IL-32阳性的肾小管与浸润的巨噬细胞空间邻近，提示IL-32可能是连接脂毒性 (lipotoxicity) 与肾脏炎症的重要分子桥梁。
论文讨论部分指出，DKD中的脂质积累驱动疾病进展已有大量证据支持。本研究将IL-32定位为这一过程的关键参与者。IL-32是一个具有多功能的细胞因子，已知在多种慢性代谢性和炎症性疾病（如非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化）中起作用，且在2型糖尿病患者血清中水平升高。本研究结果与近期其他单细胞测序研究在DKD损伤肾小管中发现IL32高表达的结果一致，但首次通过空间技术明确了其与脂滴的关联及其与免疫微环境的相互作用。
研究者提出了一个工作模型：高糖和高脂肪酸摄入导致近端肾小管内游离脂肪酸水平升高，过量的脂肪酸最初被储存在脂滴中以适应脂毒性，这是一种保护性反应。然而，持续的脂滴积累导致脂质超载和细胞应激。重要的是，脂滴积累是IL-32定位的必要但非充分条件。促炎细胞因子如TNF-α可诱导IL-32表达并驱动其募集至脂滴。升高的IL-32反过来又可能放大TNF-α信号，形成一个正反馈循环，维持慢性炎症、脂质失调、氧化应激和以KIM-1表达为标志的肾小管损伤。IL-32还可能通过细胞外囊泡释放并被浸润的巨噬细胞摄取，触发促炎反应，从而促进慢性炎症、胶原沉积、肾小管间质纤维化和DKD进展。
本研究的意义在于：1) 揭示了IL-32作为人类DKD肾小管损伤的新标志物，特别是在活动性损伤阶段；2) 为理解脂毒性如何通过特定细胞因子（IL-32）与炎症通路相连接提供了直接的空间分子证据；3) 提示IL-32有潜力作为早期DKD进展的生物标志物和潜在的治疗干预靶点。当然，IL-32在肾小管内具体是通过自分泌还是旁分泌机制发挥作用，其不同亚型的功能差异，以及其促损伤的确切分子机制，仍需未来在细胞和动物模型中进行深入的机制研究来阐明。这项研究为针对DKD中代谢-炎症轴的新型治疗策略开发打开了新的思路。
