《Mycologia》：Opportunities for maintaining and rejuvenating strain collections of Hymenoscyphus fraxineus
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本文系统探讨了实验室操作（如培养基选择与宿主回接）如何影响白蜡顶枯病菌(H. fraxineus)菌株的体外生长特性与植物内致病力。研究发现，使用白蜡叶改良培养基(AMEA)及将菌株回接至宿主植物，不仅能更好地维持菌株特性，还能有效提升其毒力，为长期保藏参考菌株及用于抗病育种等研究提供了关键的方法学依据。
引言
白蜡顶枯病菌(Hymenoscyphus fraxineus)是造成欧洲白蜡(Fraxinus excelsior)种群严重损失和死亡的主要病原真菌。抗病育种是重要的长期管理策略，但需要高效的抗性筛选方案。病原菌株通常被分离保存在菌种库中，用于后续的体外研究和温室接种试验。然而，在实验室条件下处理和保藏菌株对其生长特性和毒力的影响尚不明确。本研究旨在评估不同培养基对H. fraxineus菌株体外生长的影响，探究通过宿主回接来维持和复壮菌株毒力的方法，为长期保藏和使用参考菌株提供可靠方案。
材料与方法
研究选取了10个H. fraxineus菌株：7个来自菌种库（2007-2009年分离），3个为2020年新分离的个体。实验设计分为三个阶段，系统评估了菌株在两种培养基（麦芽提取物琼脂MEA和白蜡叶改良麦芽提取物琼脂AMEA）上的体外生长（径向生长速率和生物量）及其通过人工茎秆接种到白蜡幼苗后的植物内毒力。每个阶段后，均从发病植株重新分离病原菌，以评估宿主回接对菌株特性的影响，并利用物种特异性引物进行PCR确认。
结果
体外生物量生产与生长
菌株在AMEA上的生物量生产和日均生长速率略高于MEA，但差异不显著。宿主回接后，菌株的体外日均生长速率有所增加（尽管不显著），且生长变异增大。生长模式在回接后变得更加线性。
植物内症状发展
菌株的毒力在回接宿主后显著增强。坏死生长速率及其变异在每一实验阶段均有所增加，尤其是在第三阶段，坏死生长速率较第一阶段显著提升(P< 0.001)，且症状出现更早。与来自菌种库的菌株相比，新分离菌株的毒力更强，表现为更高的坏死生长速率、以及坏死、萎蔫、环剥和死亡率的发生率更高。
培养基类型也影响了观察到的毒力。使用AMEA培养的菌株接种后，坏死生长速率更高，症状（坏死、环剥、萎蔫）的发生也更普遍。例如，菌株C492_Schleswig-Holstein仅在AMEA上培养后才表现出毒力。然而，不同处理组间的坏死生长速率在任一实验阶段内均未达到统计学显著差异，这可能与回接后重复间的高变异有关。
体外与植物内生长的相关性
无论是第一阶段还是第二阶段，菌株的体外生长速率与植物内坏死生长速率之间均无显著相关性(RS= 0.043, P= 0.74; RS= 0.07, P= 0.67)。
讨论
对植物内毒力的影响
新分离菌株比来自保藏库的菌株毒力更强，这与之前关于菌株在体外储存过程中会丧失特性的观察一致。宿主回接显著提高了所有H. fraxineus菌株的植物内毒力，表现为坏死生长速率显著增加且症状出现更早。来自保藏库的菌株在回接后毒力增强，变得与新分离菌株更为相似，这表明回接具有复壮效果，尤其是在AMEA上培养的菌株中这一趋势更为明显。因此，未来的研究可以利用回接来复壮老化的菌株。
对体外生长特性的影响
虽然AMEA促进了菌株更高的生物量和生长速率，但差异不显著。研究表明，宿主材料中的化合物可能刺激了病原菌的生长。值得注意的是，菌株C492_Schleswig-Holstein仅在AMEA上培养并随后回接宿主后才表现出毒力，表明白蜡改良培养基可能对复壮某些菌株的毒力有效。使用AMEA仅11周后即可观察到毒力增强，且这种增强的毒力在储存11个月后依然保持。
体外与植物内生长速率的相关性
本研究未发现体外生长速率与植物内毒力之间的相关性。这与一些将菌株接种到叶片的研究结果不同，提示接种方法（茎秆 vs. 叶片）可能影响这种相关性。此外，宿主回接后，无论是体外还是植物内，实验重复间的变异均有所增加。然而，使用AMEA培养在一定程度上降低了这种变异，有助于获得更一致的结果。
结论
本研究阐明了实验室方案（如培养基选择和宿主回接）如何影响白蜡顶枯病菌菌株的体外生长特性和植物内毒力。研究结果表明，回接宿主可以增强菌株毒力，而使用白蜡改良培养基(AMEA)不仅能减少植物内症状发展的变异，还有助于复壮菌株的毒力。这些发现为长期保藏和储存参考菌株（例如用于抗病育种项目）提供了重要的方法学指导，也为恢复旧有菌种库中菌株的毒力提供了一种可能的途径。
