《Applied and Environmental Microbiology》：Evaluation of beta-propiolactone and AVL-ethanol inactivation protocols for highly pathogenic avian influenza virus in allantoic fluid and cell culture
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这项研究针对高致病性禽流感H5N1病毒（HPAI H5N1）在乳牛等哺乳动物中传播带来的生物安全挑战，系统评估了β-丙内酯（BPL）以及Qiagen AVL裂解缓冲液加95%乙醇（Buffer AVL + 95% EtOH）两种化学方法，对来自鸡胚尿囊液（allantoic fluid）和细胞培养基（cell culture media）的高滴度HPAI H5N1病毒的完全灭活效果。研究通过连续传代培养和定量RT-qPCR验证，证实了这两种方案均能有效灭活病毒，从而为后续的疫苗测试、ELISA、qPCR和RNA测序等下游应用提供了一种可在二级生物安全实验室（CL2）安全操作的样本处理方法。
引言
野生水鸟是甲型流感病毒的天然宿主，可感染H1-H16亚型，通常症状轻微。然而，带有H5或H7血凝素（HA）的亚型在禽类中传播时可能演变为高致病性禽流感病毒（HPAI），在鸡群中死亡率可达100%。1996年，中国广东省的家鹅中首次检测到一种新的HPAI H5谱系，即Gs/Gd谱系。该谱系随后扩散至野生候鸟并在全球传播，其中2.3.4.4b分支自2020年起占据主导，引起了野生和家禽的高发病率和死亡率，并开始向多种哺乳动物物种溢出感染。
2024年3月，HPAI H5N1病毒在美国的奶牛中被发现并迅速传播，已报告超过1000例，横跨17个州。这是前所未有的情况，因为牛通常不易感。目前已确认有41例与奶牛暴露相关的人类病例。病毒已从奶牛传播至其他哺乳动物，如浣熊和猫，并重新传入家禽和野生鸟类，引起了包括食用生奶的猫在内的大量动物死亡。HPAI H5N1在奶牛等哺乳动物中的循环增加了其与季节性流感病毒发生重配以及获得适应哺乳动物传播能力的突变风险。
根据加拿大和美国法规，天然的H5N1病毒因其高致病性被归为第3风险组/生物安全3级（BSL-3）病原体，活病毒操作必须在3级生物安全（CL3/BSL-3）实验室进行。尽管CL3实验室对于处理高风险病原体至关重要，但其严苛的去污流程、操作限制和繁琐的个人防护装备给研究带来了显著限制。如果下游工作无需使用活病毒，则对特定样本类型进行灭活处理，使其能在二级生物安全（CL2）实验室安全操作，将大大提高研究效率。
鸡胚是流感研究的重要工具，对禽流感病毒敏感并能产生高滴度病毒。细胞培养系统也广泛用于病毒增殖和检测。β-丙内酯（BPL）是最广泛使用的疫苗病毒灭活剂之一。BPL灭活的病毒可用于在CL2环境中测试疫苗免疫原性，也可作为ELISA检测的捕获抗原。此前已有关于多种病毒灭活方法的报道。本报告研究了BPL对含有高滴度HPAI H5N1病毒的尿囊液和细胞培养基的灭活效果，并评估了Qiagen AVL裂解缓冲液加95%乙醇的处理是否能有效灭活尿囊液中的病毒，以便在CL2条件下进行RNA测序或定量。
材料与方法
本研究使用的高致病性禽流感H5N1病毒株为A/dairy cattle/Texas/24-008749-002/2024。研究在加拿大萨斯喀彻温大学疫苗与传染病组织（VIDO）的CL3实验室中进行。使用犬肾（MDCK）细胞进行病毒培养和测定。将H5N1接种11日龄鸡胚尿囊腔，感染3天后收获尿囊液。
BPL处理：取200 μL含有H5N1的细胞培养上清液（滴度为5.6 × 107TCID50/mL）或尿囊液（滴度为3.3 × 108TCID50/mL），用BPL处理至终浓度为0.1%或0.2%。调节pH至中性，在4°C孵育16-18小时，随后在37°C水解残留BPL2小时，离心后取上清用于检测。
AVL-乙醇灭活：将感染H5N1病毒的鸡胚尿囊液稀释1:4后，取140 μL与560 μL AVL裂解缓冲液混合，室温孵育10分钟，再加入560 μL 95%乙醇并孵育10分钟。
使用100 kDa Amicon Ultra-4离心过滤装置去除灭活处理样品中细胞毒性成分。随后将处理过的样品接种到MDCK细胞单层上，吸附1小时后更换为病毒生长培养基。连续观察3天细胞病变效应（CPE）。在第3天收集上清，一部分用于下一轮接种，另一部分用于RNA提取和病毒RNA检测。此过程共进行四轮连续传代。
使用Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA。采用针对甲型流感病毒基质蛋白（M）基因的引物和探针进行定量RT-PCR，并通过标准曲线将Ct值转换为TCID50当量。
为确定检测限（LOD），将已知滴度病毒的RNA进行系列稀释，每个稀释度进行20次技术重复检测。将能在至少95%的重复中检测到的最低病毒量定义为LOD。
结果
检测限的确定
通过RT-qPCR标准曲线分析，确定RNA检测限（LOD）为5.6 TCID50，对应的平均Ct值为36。在本研究体系中，Ct值>36.0被视为不存在感染性病毒的有效指标。有效的病毒灭活被定义为在四轮连续传代中均无细胞病变效应，且Ct值>36.0并呈递增趋势，或连续传代中Ct值始终>36.0。
BPL的病毒灭活效果
实验设计了四种测试样品：测试品#1为组织培养来源H5N1经0.1% BPL处理；测试品#2为组织培养来源H5N1经0.2% BPL处理；测试品#3为鸡胚尿囊液来源H5N1经0.1% BPL处理；测试品#4为鸡胚尿囊液来源H5N1经0.2% BPL处理。所有经BPL处理的样品，无论处理浓度或样本来源如何，在MDCK细胞中进行四轮接种后均未引起任何细胞病变效应。RT-qPCR分析显示，所有测试品在传代过程中Ct值均增加或始终维持在较高水平，无病毒RNA扩增证据，表明无有效的病毒复制。例如，测试品#1（0.1% BPL处理细胞培养病毒）在第一轮第3天的Ct值为32.9，随后几轮均≥36.4。测试品#3（0.1% BPL处理尿囊液病毒）在第一轮第3天Ct值为28.0，第二轮增至38.6，第三轮38.3，第四轮未检测到。0.2% BPL处理组（测试品#2和#4）也表现出相同的有效灭活模式。
作为阳性对照，感染细胞来源或鸡胚来源H5N1活病毒的MDCK细胞在每一轮均表现出完全的细胞病变效应，且Ct值在后续传代中持续降低，证实了活跃的病毒复制。作为阴性对照，接种仅含培养基或清洁尿囊液的MDCK细胞未出现细胞病变，且Ct值始终高于36.4。
AVL裂解缓冲液加95%乙醇的病毒灭活效果
为了评估Qiagen QIAamp Viral RNA试剂盒中AVL裂解缓冲液与乙醇对鸡胚尿囊液中H5N1的灭活能力，将含病毒尿囊液用Buffer AVL和95%乙醇处理（测试品#5）。在MDCK细胞中进行四轮连续传代期间，任何一轮感染后第3天均未观察到细胞病变效应，表明病毒被有效灭活。RT-qPCR分析显示，培养上清中初始可检测到病毒RNA（第0天Ct值30.6），第一轮第3天Ct值增至35.3，这表明检测到的RNA是残留的输入物质，而非新合成的病毒基因组。在随后的几轮中，Ct值稳定地维持在>37.2，表明没有病毒复制的证据。
作为对照，接种经AVL处理的清洁尿囊液或未处理的清洁尿囊液的MDCK细胞均未出现细胞病变，且各轮次Ct值均>36.4。相比之下，接种未经处理的含H5N1病毒尿囊液的MDCK细胞（阳性对照#2）始终表现出强烈的细胞病变效应和高病毒载量，Ct值持续走低，证实了活跃的病毒复制。
讨论
本研究测试了使用0.1%和0.2%浓度的BPL灭活来自鸡胚尿囊液和细胞培养基的HPAI H5N1病毒的效果。BPL能使病毒RNA中的鸟嘌呤碱基发生烷基化，干扰病毒转录，因为聚合酶会将修饰的鸟嘌呤误读为腺嘌呤。BPL也能与某些氨基酸反应，这可能也会影响其感染性。研究发现，经BPL处理后，无论是哪种样本类型，在MDCK细胞的四轮连续传代中均未诱导细胞病变效应。同时，RT-qPCR分析显示传代过程中Ct值并未降低，表明没有病毒复制发生。这些结果共同证明，所测试的两种BPL浓度均能有效灭活尿囊液和细胞培养基中的H5N1病毒。
研究还评估了用95%乙醇结合Qiagen AVL裂解缓冲液处理尿囊液是否能灭活其中的HPAI H5N1病毒。AVL裂解缓冲液含有高浓度的异硫氰酸胍，是一种离液剂，可裂解细胞并破坏大分子稳定性。针对埃博拉病毒的研究表明，单独的AVL缓冲液可降低病毒感染性，但完全灭活需要加入乙醇。本研究团队先前的工作也表明，AVL缓冲液加95%乙醇能完全灭活牛奶、尿液和血液等多种生物样本中的HPAI H5N1病毒。基于此，本研究测试了AVL缓冲液与95%乙醇联用对尿囊液中HPAI H5N1的灭活效果。与BPL处理结果相似，经AVL+乙醇处理的尿囊液样品在连续传代后，既未观察到细胞病变效应，也未出现病毒RNA水平的增加。这些发现表明，在本研究的实验条件下，AVL缓冲液与95%乙醇的组合能有效灭活尿囊液中的H5N1病毒，从而允许样本从CL3安全转移至CL2实验室进行下游分析。我们承认一个局限性：即使所有病毒颗粒都已灭活且不再具有感染性，病毒RNA可能仍然会存在。
总之，本研究为使用多种化学试剂灭活存在于不同样本中的HPAI H5N1病毒提供了有效的实验方案。这些方案确保了生物安全合规性，使得灭活后的病毒材料能在较低防护等级的实验室中安全操作，同时不损害研究的完整性或公共卫生安全。
