《Journal of Clinical Microbiology》：Accuracy of nanopore-based targeted next-generation sequencing assay for detection of Mycobacterium tuberculosis and drug resistance from non-sputum specimens: a multicenter prospective study in China
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本研究推荐您关注这篇前瞻性研究，它系统评估了纳米孔靶向测序（tNGS）在中国五家定点结核病医院非痰标本（如支气管肺泡灌洗液）中的诊断表现。结果显示，相较于微生物参考标准（MRS），tNGS展现出高灵敏度与特异性（分别为93.4%和93.2%），尤其在菌载量低的患者中优势明显。该方法不仅能快速诊断结核病（TB），还能同时检测耐药性（包括利福平、异烟肼、链霉素等）及共感染的其他呼吸道病原体，为优化结核病（尤其是非痰标本患者的）诊断策略提供了有力证据。
引言
结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）引起的主要公共卫生挑战。在2023年，全球有超过1080万人罹患结核病，并造成130万人死亡。尤其值得注意的是，新冠病毒大流行逆转了结核病发病率的下降趋势。常规结核病诊断方法存在局限：痰涂片镜检灵敏度相对较低；作为金标准的结核分枝杆菌培养耗时长达2个月；而基于PCR的核酸检测虽缩短了检测时间，但由于荧光通道有限，难以同时检测多个靶点。近年来，以纳米孔测序为代表的靶向下一代测序（targeted next-generation sequencing, tNGS）技术因其快速实时测序能力和超长读长，在细菌性下呼吸道感染临床诊断中展现出潜力。然而，其在活动性结核病，特别是非痰标本中的诊断性能知识仍然有限。为此，本研究在中国开展了一项多中心前瞻性研究，旨在评估基于纳米孔的tNGS检测多种非痰标本中MTB及其耐药性的准确性。
材料与方法
本研究是一项诊断准确性研究，在位于中国北部和南部的五家结核病定点医院（黑龙江、北京、重庆、杭州、广州）开展。从2023年12月至2024年6月，共招募701名具有活动性结核病临床指征的成年患者（年龄≥18岁），收集其非痰标本。标本类型包括支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluids, BALFs）、胸腔积液或腹水、脑脊液、脓液、穿刺液和新鲜组织。所有标本在4°C保存，并在24小时内进行处理。
标本经过标准化预处理后，分为三部分用于以下检测：1) 结核分枝杆菌培养及表型药敏试验（Phenotypic Drug Susceptibility Test, pDST）；2) Xpert Mycobacterium tuberculosis(MTB)/RIF（Xpert）检测；3) tNGS检测。tNGS检测流程包括DNA提取、多重靶向PCR扩增、文库构建及在纳米孔平台（GridION，使用R10.4.1流动槽）上进行测序。靶向基因面板涵盖49种分枝杆菌和31种其他病原体的鉴定基因，以及19个与MTB耐药相关的基因（如rpoB、katG、inhA、embB等）。测序数据经过碱基识别、质量过滤、去除人类序列后，比对至内部微生物基因组数据库和耐药突变数据库进行分析。
研究的参考标准是微生物参考标准（Microbiological Reference Standard, MRS），定义为培养和/或Xpert检测结果为阳性。统计学分析使用混淆矩阵计算tNGS的敏感性、特异性等指标。
结果
参与者入组与临床特征
研究共入组701名参与者，平均年龄48.7岁，62.8%为男性。其中90.6%的参与者提供了BALF标本。基于MRS，438名（62.5%）参与者被诊断为活动性结核病。tNGS的MTB检出率最高（60.9%），高于培养（41.4%）和Xpert（58.8%）。
tNGS对活动性结核病的诊断性能
以MRS为金标准时，tNGS的敏感性和特异性分别为93.4%（95% CI， 91.5%–95.2%）和93.2%（95% CI， 91.3%–95.0%）。研究还发现，tNGS在无症状结核病患者与有症状患者中表现出相似的诊断准确性。当按标本类型分层分析时，BALF标本的敏感性为93.4%，特异性为92.6%；其他类型标本（如胸腔积液、脑脊液、脓液等）的敏感性在83.3%至100%之间。此外，tNGS的读数计数与Xpert半定量分级呈正相关，表明其与标本中的细菌载量有关。
tNGS对MTB及其他共感染呼吸道病原体的检测
在427名tNGS阳性个体中，约5.2%（22/427）存在非结核分枝杆菌（Nontuberculous Mycobacteria, NTM）共感染，如脓肿分枝杆菌复合群和胞内分枝杆菌。此外，研究还发现一部分结核病患者合并感染了其他呼吸道病原体，如肺炎克雷伯菌和流感嗜血杆菌。
tNGS对耐药性检测的诊断准确性
研究评估了tNGS对18种抗结核药物耐药突变的检测能力。在427名tNGS阳性个体中，93.7%（400/427）获得了完整或部分的耐药谱。tNGS成功获取耐药谱的能力依赖于细菌载量：在Xpert分级为“高”的标本中，完整检出率达100%，而在“极低”分级中仅为35.9%。在268份培养阳性且有表型药敏结果的标本中，tNGS与表型药敏试验结果具有高度一致性（总体一致性从94.8%到98.9%不等）。针对特定药物，与表型药敏试验相比，tNGS检测耐药性的敏感性（特异性）分别为：利福平（Rifampicin, RIF）92.6%（100%）、异烟肼（Isoniazid, INH）88.2%（98.7%）、链霉素（Streptomycin, STM）85.4%（96.5%）、乙胺丁醇（Ethambutol, EMB）82.4%（98.8%）、左氧氟沙星（Levofloxacin, LFX）86.2%（99.6%）。值得注意的是，研究在部分中国人群中观察到了贝达喹啉（Bedaquiline, BDQ）耐药相关突变。
讨论
本研究证实，tNGS检测在诊断活动性结核病方面表现出优于标准Xpert和培养方法的敏感性和特异性，尤其是在菌载量低的参与者中。这对于诊断无症状结核病（通常菌载量较低）具有重要意义。tNGS还能同时检测NTM共感染和其他呼吸道病原体，为理解复杂的宿主-病原体相互作用提供了新视角。在耐药性检测方面，tNGS能够快速提供广泛的耐药谱，显示出作为疑似耐药结核病患者初始诊断工具的潜力，有望为耐多药（Multidrug-Resistant, MDR）或耐利福平（Rifampicin-Resistant, RR）结核病患者提供个性化护理前景。研究观察到的贝达喹啉耐药趋势也强调了常规监测的重要性。
当然，本研究也存在一些局限性，例如在耐药结核病患者中的样本量较小导致置信区间较宽；大部分标本为BALF，可能限制结论在肺外结核标本中的普适性；由于研究期间的条件限制，使用了Xpert而非更灵敏的Xpert Ultra作为参考方法；未对新的和重新使用的抗结核药物进行体外药敏测试等。
结论
总而言之，tNGS检测是一种快速、高灵敏度的工具，可用于非痰标本的结核病病例检测和同步耐药性检测。与传统方法相比，其敏感性优势在菌载量低的结核病患者中最为显著。未来研究需要优化tNGS检测的临界值，以在诊断或筛查的不同目的下平衡敏感性与特异性，从而提升其临床效用，助力结核病防控。
