《Journal of Virology》：The origins and potential cross-species transmission of paramyxoviruses and other RNA viruses between native snakes and invasive Burmese pythons in the Florida Everglades
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本文首次报道了在野生蛇类（东部泥蛇）中暴发的爬行动物费拉病毒疫情，并对该病毒进行了生物学表征，揭示了其特有的U蛋白与病毒包涵体的关联。同时，在对入侵物种缅甸蟒的调查中，发现了包括50多年来美国首例陆地甲病毒在内的多种新型RNA病毒。这些发现不仅拓展了爬行动物病毒的多样性认知，也警示了入侵物种携带的病原体对本地野生动物构成的潜在跨物种传播风险。
费拉病毒在野生蛇类中的首次暴发与病原特征
在2020年11月至12月期间，美国佛罗里达州大沼泽地生态系统记录到东部泥蛇出现疾病暴发。患病蛇被观察到在河岸扭曲翻滚，并伴有泡沫状口腔分泌物。病理学检查显示其患有坏死性肠炎和肺水肿，并分离出一种在系统发育上与森蚺副粘病毒相关的爬行动物费拉病毒。虽然费拉病毒是全球动物园和私人养殖场蛇类中已知的病原体，但这是首次在自由生活的野生蛇群中记录的费拉病毒暴发事件。
泥蛇病理学检查结果
对两只死亡泥蛇的尸检显示，最显著的病变出现在胃肠道和肺部。其中一条蛇的肠壁严重增厚并呈透壁性发红，显微镜下可见中度、亚急性、多灶性、异嗜性和坏死性肠炎伴广泛黏膜变钝。两条蛇均有弥漫性、明显的肺水肿和血管充血。此外，在一条蛇的胃和肠道肌肉层中发现了线虫，脾脏部分的淋巴组织明显耗竭，另一条蛇的胰腺中则出现了腺泡上皮细胞的多灶性坏死。
病毒分离与进化分析
从泥蛇的肠道和肾脏中分离出一株爬行动物费拉病毒。基因组测序分析显示，该病毒基因组全长15，378个核苷酸，与2011年至2012年及2015年从香港海洋馆绿森蚺中分离的副粘病毒具有最高的核苷酸同源性（97.7%–97.8%）。基于L基因序列的系统发育分析表明，泥蛇病毒与来自香港的森蚺分离株，以及从秘鲁进口到法国和德国的凯门鳄蜥蜴中检测到的病毒聚为一支，共同构成了费拉病毒的A基因型。
独特的U蛋白：表达、定位与功能初探
费拉病毒在副粘病毒中独树一帜，其基因组在N和P基因之间有一个额外的开放阅读框，编码功能未知的U蛋白。本研究首次在病毒感染细胞中可视化了U蛋白的时空表达。研究发现，在感染早期（12小时），U蛋白在细胞质中分散为点状聚集；到24小时，这些聚集物凝结成更大的包涵体样结构；至48-72小时，U蛋白形成更复杂的形态，并在细胞质中占据更大比例。在东部箱龟心脏细胞中，U蛋白在合胞体内围绕细胞核形成独特的环状结构。
为了探究U蛋白是否足以单独形成包涵体，研究团队进行了质粒转染实验。结果显示，当U蛋白单独表达时，仅形成小的点状聚集物；而当U蛋白与N蛋白、P蛋白共转染时，三者共同定位在光滑的球形包涵体中，表明U蛋白通过与N、P蛋白或N-P复合物相互作用，被招募到由N和P驱动的液-液相分离形成的病毒包涵体中。
病毒宿主范围与温度依赖性研究
研究评估了泥蛇费拉病毒分离株在多种爬行动物细胞系中的相对感染性和复制适应性。实验使用了来自缅甸蟒心脏、东部箱龟心脏和守宫肺的细胞系，这些物种均存在于佛罗里达大沼泽地。免疫荧光检测表明，所有测试的爬行动物种细胞均对病毒感染易感，其中在蛇类和龟类细胞中感染更为广泛，而在守宫细胞中感染则相对受限。多步生长曲线显示，病毒在缅甸蟒细胞中复制能力最强，其次为蝰蛇细胞、东部箱龟细胞，在守宫细胞中复制速率和滴度最低。
温度依赖性实验发现，该病毒在低于哺乳动物正常体温（37°C）的条件下才能复制，最适复制温度在28°C至31°C之间，在25°C和34°C时复制能力相对降低，在37°C时复制被完全抑制。这表明蛇类的体温（无论在野生还是圈养环境下）可能对费拉病毒感染的结果有重大影响，较高的体温会限制病毒复制，进而可能影响致病性。
缅甸蟒中的病毒发现：从疱疹病毒到新型甲病毒
为了探寻泥蛇疫情病毒的潜在自然来源，研究团队对疫情地点及周边捕获的40条入侵物种缅甸蟒进行了费拉病毒及其他病毒筛查。虽然未检测到费拉病毒，却意外发现了多种新型RNA病毒。
首先，在一只表现出过度流涎临床症状的缅甸蟒个体中，通过RNA测序鉴定出一种新型肝炎病毒，暂命名为缅甸蟒肝炎病毒。该病毒多蛋白的N端区域相较于原型丙型肝炎病毒显著延长，结构建模分析显示，其N端区域包含一个与HCV NS2-3蛋白酶高度同源的结构域，并具有相同的催化三联体（组氨酸-天冬氨酸/谷氨酸-半胱氨酸），提示其可能是一个通过基因复制进化而来的、具有蛋白酶活性的新型非结构蛋白（暂命名为NS6）。系统发育分析显示，BuPyHV与来自田鼠和中国猪尾鼠的肝炎病毒聚为一支。对该催化三联体的分布分析发现，其在低等脊椎动物（如鱼类和爬行动物）的肝炎病毒中保守存在，而在哺乳动物肝炎病毒中却完全缺失。
此外，该蟒蛇还共感染了一种蛇病毒。系统发育分析表明，此病毒与先前在南佛罗里达州缅甸蟒中发现的蛇病毒属于同一进化支，共同构成Septovirus属。
缅甸蟒病毒筛查的广泛发现
对40条缅甸蟒的口腔和泄殖腔拭子进行RNA测序和特异性PCR筛查，揭示了其携带的丰富病毒群落。
其中最引人注目的发现是一种新型甲病毒，暂命名为伊甸甲病毒。RT-PCR筛查显示，该病毒在30%（12/40）的蟒蛇中呈阳性，且主要从泄殖腔拭子中检出。系统发育分析基于nsP2氨基酸序列进行，结果显示EDEV与2019年在巴西库蚊中首次发现的卡因瓜病毒关系最为密切，可能代表一个新的抗原/遗传复合体。这是50多年来在美国大陆发现的首个新型甲病毒。
研究还鉴定出一种新型动脉炎病毒（缅甸蟒动脉炎病毒），以及先前已描述的蛇病毒。值得注意的是，高达57.5%（23/40）的蟒蛇同时感染了两种或三种病毒，其中最常见的共感染组合是蛇病毒与肝炎病毒。蟒蛇的体重、体长或性别与病毒感染数量之间没有统计学关联。
讨论与展望
本次在野生东部泥蛇中暴发的费拉病毒疫情是首次记录，其临床症状和病理表现与圈养蛇类的感染报告相符。病毒来源尚不明确，可能与入侵的蟒蛇或森蚺有关，也可能源自本地蛇类或其他爬行动物。同时期在佛罗里达州另一地点东部靛蓝蛇中发现的C基因型费拉病毒，提示该州可能已存在并建立了多种费拉病毒基因型。
对费拉病毒特有U蛋白的研究初步揭示了其与病毒包涵体的时空关联及与N、P蛋白的相互作用，为理解这一独特蛋白的功能奠定了基础。病毒宿主范围和温度依赖性研究表明，费拉病毒能感染多种爬行动物细胞，但复制受温度严格调控。
在入侵物种缅甸蟒中发现的病毒多样性令人惊讶且具有重要意义。新型肝炎病毒中NS2样蛋白酶结构域的发现，为了解肝炎病毒在脊椎动物中的进化提供了新视角。而伊甸甲病毒的发现，不仅拓展了甲病毒的已知多样性，也提出了关于其生态、宿主范围和传播动态的新问题。缅甸蟒作为大沼泽地中数量庞大且已建立的入侵物种，其捕食行为对本地野生动物的影响已备受关注，但它们所携带的病原体及其对本地物种的潜在跨物种传播风险却研究不足。
因此，厘清入侵物种携带的完整病毒组，加强对本地爬行动物的监测，以及及时报告异常死亡事件，对于保护佛罗里达乃至全球的生物多样性至关重要。这项研究不仅首次记录了野生蛇类的费拉病毒疫情，加深了对该病毒生物学特性的理解，更重要的是，它揭示了入侵缅甸蟒作为一个“病毒库”的潜在风险，强调了在生物入侵背景下，病原体跨物种传播对生态系统健康的深远影响。
