一项新的轮状病毒外衣壳蛋白VP7糖基化形式从极化细胞分泌并激活天然免疫细胞

《Journal of Virology》：A novel glycoform of the rotavirus outer capsid protein VP7 is secreted from polarized cells and activates innate immune cells

该研究首次报道了一种新发现的轮状病毒VP7蛋白糖型，其从受感染的极化肠上皮细胞中分泌，而非与病毒颗粒结合。通过质谱技术，研究发现这种分泌型VP7携带复杂型N-聚糖和O-聚糖修饰。功能实验表明，分泌的VP7能以三聚体形式存在，能被中和抗体识别，并可作为Toll样受体(TLR)的激动剂激活多种天然免疫细胞。这揭示了轮状病毒结构蛋白除了构成病毒衣壳之外，在调节宿主固有和适应性抗病毒免疫方面可能扮演重要角色，具有全新的免疫调节功能。

　　

轮状病毒(RVs)是无包膜动物病毒家族中的独特成员，其基因组编码一种结构糖蛋白VP7。该蛋白在病毒的外层衣壳中形成三聚体。以往研究认为，受感染细胞中，VP7在内质网中被糖基化修饰后，会一直保留在内质网中，直到病毒颗粒形态发生的后期阶段才被组装到病毒上。但本文研究揭示了一个此前未被发现的现象：在极化的人类结肠腺癌细胞(Caco-2)中，有相当一部分VP7会独立于病毒颗粒被分泌到细胞外，形成一种分子量更高的新型糖型，即分泌型VP7。

本研究利用Caco-2细胞和猴肾细胞(MA104)进行同步感染实验。感染后通过监测细胞质乳酸脱氢酶(LDH)的释放来评估细胞存活率，并通过免疫印迹分析病毒蛋白在细胞裂解液和培养基组分中的分布。研究发现，在感染Caco-2细胞24小时后，培养基中存在一种高分子量形式的VP7，而在MA104细胞中则未检测到。超速离心分析证实，这种高分子量的VP7和轮状病毒非结构蛋白NSP4仅存在于上清液中，表明它们是从受感染细胞中独立于病毒颗粒主动分泌的。相比之下，病毒的主要结构蛋白VP6以及与病毒颗粒相关的低分子量VP7则在超速离心的沉淀物中被回收。

研究团队进一步探究了分泌型VP7高分子量的原因。考虑到VP7的N-连接糖基化位点位于Asn₆₉，研究人员使用内切糖苷酶H和PNGase F进行酶切处理。免疫印迹分析显示，细胞裂解物和病毒颗粒中的VP7对EndoH敏感，表明其携带的是寡甘露糖型N-糖链，这是内质网驻留蛋白的典型特征。然而，分泌型VP7对EndoH处理不敏感，而对PNGase F处理敏感。尽管PNGase F处理后sVP7的分子量有所下降，但其表观分子量并未降至与细胞或病毒相关VP7处理后的相同大小。此外，利用植物凝集素（如伴刀豆球蛋白A和麦胚凝集素）进行的结合实验也证实了sVP7上的聚糖谱发生了变化。

为了验证sVP7是否通过常规分泌途径运输，研究人员使用了破坏高尔基体功能的药物进行干预。布雷非德菌素A能够将顺面高尔基体成分重新分布到内质网中，而莫能菌素则能阻断来自反面高尔基体网络的囊泡运输。实验表明，这两种药物都显著抑制了sVP7在培养基中的分泌，而细胞骨架微丝破坏剂细胞松弛素D则无此抑制作用，这证实了sVP7的分泌依赖于功能性高尔基体。

在极化培养的Caco-2细胞模型（在可渗透滤膜上培养）中，研究团队观察到sVP7与病毒颗粒及NSP4一样，也呈现出极性的顶部分泌模式，而基底外侧培养基中几乎检测不到。这进一步印证了其在生理相关的细胞模型中可能具有特定的生物学功能。

分泌型VP7是否保留了其作为病毒衣壳蛋白的关键构象特性？研究人员利用两种针对VP7的中和性单克隆抗体进行免疫沉淀实验，发现mAb 159和4C3均能结合sVP7，表明sVP7保留了病毒外衣壳中存在的构象依赖性中和表位。由于这些表位的识别依赖于三聚体的形成，研究团队进一步通过尺寸排阻色谱(SEC)分析纯化的sVP7。结果显示，sVP7在含有Ca²⁺的缓冲液中表现为均一的三聚体形式（表观分子量约161.9 kDa），而在含有EDTA的缓冲液中则解聚为单体（表观分子量约54.4 kDa），这证实了sVP7是以钙离子依赖性的三聚体形式分泌的。

研究采用LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）技术对sVP7进行了详细的糖链谱分析。结果显示，sVP7共携带70种N-糖链结构，绝大多数为复杂型糖链，主要特征是含有平分型N-乙酰葡糖胺和核心岩藻糖基化。主要的N-糖链为双天线型，末端带有α2,6唾液酸化。令人惊讶的是，分析还发现了41种O-聚糖结构，主要为粘蛋白类型的核心1和核心2型O-聚糖，其中大部分也带有唾液酸化和/或岩藻糖基化。这些广泛的糖基化修饰解释了为何PNGase F处理后sVP7的分子量仍高于未修饰蛋白的原因。

考虑到sVP7新颖的糖链特征可能赋予其类似病原体相关分子模式的生化活性，研究人员探究了其激活Toll样受体(TLR)信号通路的能力。利用表达TLR2、TLR4或两者都不表达的HEK293T报告细胞系进行实验，发现sVP7在最高测试浓度下能够激活TLR2和TLR4信号通路，诱导NF-κB（核因子κB）活化，而分泌型NSP4对TLR2的激活作用更强。这表明sVP7可能作为一种新型病毒配体与免疫受体相互作用。

为了更贴近生理环境，研究进一步使用人全血模型评估sVP7的免疫刺激潜力。全血样本分别用纯化的sVP7、sNSP4以及TLR2激动剂进行刺激。流式细胞术分析表明，sVP7能以剂量依赖性的方式上调经典单核细胞表面的CD80表达和自然杀伤(NK)细胞表面的CD69表达，同时下调中性粒细胞表面的CD62L表达，这是中性粒细胞对促炎刺激激活的已知标志。这些数据共同表明，sVP7能够诱导多种天然免疫细胞亚群的活化。

研究讨论部分指出，本发现修正了对非包膜病毒仅通过细胞裂解释放的固有认知。VP7作为一种主要的结构蛋白，其独立于病毒颗粒的分泌以及此前未被认识的翻译后糖基化修饰，为其功能增添了新的维度。分泌的sVP7保留了病毒外衣壳中的三聚体构象和中和表位，这提示它可能作为一种“诱饵”抗原，干扰针对轮状病毒的中和抗体反应。同时，其激活TLR通路并诱导多种天然免疫细胞活化的能力，为轮状病毒感染期间调控宿主免疫应答提供了新的机制。糖链分析揭示的复杂型N-聚糖和O-聚糖也为sVP7与宿主细胞表面凝集素受体相互作用，进而塑造抗病毒免疫反应提供了潜在途径。然而，本研究使用的SA11毒株是经细胞培养适应的猴源轮状病毒株，不同轮状病毒毒株的VP7糖基化位点存在差异，因此其分泌和免疫调节特性是否具有普遍性，仍需在未来利用更多人源毒株进行验证。总之，本研究为轮状病毒结构蛋白VP7发现了超越其衣壳组装功能之外的新角色，为理解病毒-宿主相互作用和抗病毒免疫调节开辟了新的研究方向。